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科研学霸天团，48小时有问必答

问做免疫荧光经验求分享？

毛利小五郎的徒弟

如果核定位不好,建议封闭和打孔合为一步,即在封闭液中添加0.5% TRITON-100,37度封闭2小时,加一抗后最好4度孵育过夜(16小时)。

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问免疫电泳实验中，电泳条件已经优化，但仍然无法分辨出目标蛋白。我该如何提高分辨率和灵敏度？

毛利小五郎的徒弟

可以在电泳之前应用免疫沉淀法将抗原进行纯化

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问病毒中和实验中，如何确定最佳的病毒和细胞比例以获得最高的病毒中和效果？

龙大人驾到

1. 初始的病毒和细胞比例可以根据文献或前人经验进行初步选择。2. 进行一系列病毒和细胞比例的实验，产生一组数据，以评估不同比例下的中和效果，并确定最佳比例。3. 可以通过稀释病毒溶液来获得不同的病毒浓度。例如，对于包含106个病毒的溶液，可以通过将其与相应量的培养基混合并逐步稀释到10-6的浓度。4. 对于每种稀释物，与一定数量的细胞进行接种。接种后，可以根据实验需要和方法使用不同的检测方法（例

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问免疫荧光实验中，如何选择最佳的探针以获得最高的灵敏度和特异性？

huarenqiang5

荧光探针的选择主要从以下几个方面考虑。（1）仪器所采用激光器的类型：应根据仪器采用激光器的类型进行探针选择。如共聚焦激光扫描显微镜采用氪/氩离子激光器，激发波长为488nm，568nm，647nm，可激发多种荧光探针。（2）荧光探针的光稳定性和光漂白性：在进行荧光定量和动态荧光监测时，要求荧光探针有较高的光稳定性，也可通过减少激光扫描次数或降低激光强度的方法，来减轻光漂白的程度。但在进行膜流动性或

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问求助！求一个RAW264.7巨噬细胞极化CD86和CD206流式protocol

loveliufudan

以下是CD86和CD206流式细胞分析的基本流程和protocol：CD86和CD206的流式细胞分析基本流程：1.制备单细胞悬液2.细胞表面标记抗体染色3.流式细胞分析仪分析CD86的流式细胞分析protocol：1.用PBS洗涤细胞，离心收集；2.用离心管离心收集细胞，弃去上清液，细胞用0.5mLPBS重悬；3.加入0.5μL CD86-FITC标记抗体，室温孵育30min；4.再次用PBS洗

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问LD和MS分选柱怎么重复利用呢

huarenqiang5

每次分选完用buffer反复冲洗柱子几遍后用无水乙醇冲洗几遍，再放入有无水乙醇容器里完全浸泡(一定要无水，不然就会生锈)，等做完实验再拿出来把柱中的无水乙醇打出，放置到一个小铁饭盒里拿去高压灭菌，在放到干燥箱里干燥就可以了，下次用的时候再拿到超净台里打开铁饭盒，用无菌镊子取出继续利用。

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问T细胞增殖是否成团

huarenqiang5

一般正常情况大概20%左右细胞成团，一直会持续到14-16天左右才散开。一定程度影响细胞增殖倍数。

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问thp-1诱导后的巨噬细胞有什么作用？ M0,M1,M2有什么区别？求各位大佬解答

asswei

作用：①作为抗原提呈细胞；②杀伤肿瘤效应细胞；③巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的机制；④活化的巨噬细胞与肿瘤细胞结合后，通过释放溶解细胞酶直接杀伤肿瘤细胞；⑤处理和呈递肿瘤抗原，激活T细胞以产生特异性抗肿[医学教育网原创]瘤细胞免疫应答；⑥巨噬细胞表面上有FC受体，可通过特异性抗体介导ADCC效应杀伤肿瘤细胞；⑦活化的巨噬细胞可分泌肿瘤坏死因子（TNF）等细胞毒性因子和产生超氧化代谢产物间接杀伤肿瘤细胞。巨

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问免疫实验中的控制实验是什么，它们为什么很重要？例如，如何利用阴性和阳性对照来确定实验结果的可靠性？

毛利小五郎的徒弟

阳性对照实验和阴性对照试验是生物学实验中常用的两种对照方法。其中阳性对照实验是对对照组施以能发生阳性反应的处理，其目的是显示阳性反应结果;而阴性对照实验是对对照组施以发生阴性反应的处理，目的是排除假阳性反应的干扰。阴性对照实验与空白对照试验并不完全相同，阳性对照实验和阴性对照试验是针对“预期结果”而言，其预期结果分别为阳性反应与阴性反应，其中阴性对照实验可采用安慰剂处理，也可采用空白对照处理。而空

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问氯霉素培养基要怎么配？浓度是34mg/ml 配1L一次就没了？（是不是）工作浓度∶严密型质粒25微克每毫升松弛型质粒170微克

龙大人驾到

配制氯霉素培养基的步骤如下：称取34克培养基粉末加入到1升去离子水中，充分溶解。加入氯霉素盐酸盐，将其溶解至所需浓度。根据您提供的信息，严密型质粒工作浓度为25微克/毫升，松弛型质粒工作浓度为170微克/毫升。因此，如果您要配制1升氯霉素培养基，需要加入25毫克严密型质粒和170毫克松弛型质粒的氯霉素盐酸盐。用去离子水调整溶液体积至1升，充分混合。

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问细胞免疫实验测定蛋白质定位

asswei

有3种方法可以测定蛋白质定位：1、免疫结合法2、同位素跟踪法3、探针法

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问coIP/抗原抗体过夜有沉淀/非特异

loveliufudan

您可以尝试以下几个方法：优化裂解液成分和pH值减少孵育时间和温度在加入磁珠前离心取上清，并且在加入磁珠后再次离心去除残留絮状物

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问转录组分析

loveliufudan

如果你想要获取上调前20%的基因，你可以根据Log2FoldChange从大到小进行排序，然后取前20%的基因。例如：共有100个上调基因，对这些基因根据Log2FoldChange从大到小进行排序，然后取前20个基因。但是，仅仅根据Log2FoldChange来筛选差异表达基因可能不够准确，还需要考虑FDR（错误发现率）这个指标。FDR是通过对p值进行校正得到的，反映了差异表达分析中假阳性的概率

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问求助，小鼠脾脏淋巴细胞的培养

李瑛玉

你好，我看文献大家用pha、刀豆蛋白、lps。不知道是不是你想要的答案。另外我在搞小鼠脾脏淋巴细胞和干细胞的共培养……(˵¯͒〰¯͒˵)想交流一下请教一些问题可以么？

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问求助！怎么检测自身反应性T细胞

asswei

T细胞上有绵羊红细胞受体，可形成E花环，E花结试验可用于计数T淋巴细胞。

4 回答60 围观

问可以看见明显趋势但actin不齐可以用吗

balalaLy

应该不行，NC组的内参太糊了，跟过表达差异那么大，这种情况会被质疑你的转染本身对细胞有影响。建议调一下上样量再跑一次

5 回答76 围观

问HIV胶体金试纸研发问题

huarenqiang5

主要考虑样本本身问题或PH值问题导致。

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问有做THP-1巨噬细胞M2极化成功的吗？

毛利小五郎的徒弟

建议添加pma，可以提高极化成功率

3 回答149 围观

问求助免疫电镜

loveliufudan

免疫电镜是一种结合免疫学和电子显微镜技术的方法，用于检测细胞或组织中的特定蛋白质或抗原。以下是一般的免疫电镜步骤：制备样品：样品可以是细胞或组织，需要进行固定和包埋处理。固定通常使用戊二醛或氧化亚铊等交联剂。包埋处理通常使用树脂，如Epon或Araldite。切片：用超薄切片机将包埋样品切成70-100纳米的薄片，然后将其放在电镜网格上。抗体标记：将特定的抗体与金颗粒等标记物结合。抗体可以是单克隆

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问细胞实验，脂多糖LPS的配置

asswei

LPS可溶于水中(5 mg/ml)，或是细胞培养基中(1 mg/ml)。LPS分子在任何溶液中都会形成微粒。溶于水中或是磷酸盐缓冲液中形成混悬液。在有机溶剂也是一种混悬液。细胞培养时，将LPS溶于装有1 ml无菌平衡盐溶液或是细胞培养基的小管中，轻轻摇晃直至其完全溶解。再加入无菌平衡盐溶液或是培养基直至配成工作浓度的母液。1 mg/ml浓度的溶液可在2-8℃中稳定保存1月左右，分装后于-20℃中可

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