如何用HPLC法测定辣根过氧化物酶中同工酶C的含量？

你可以按照以下步骤进行:

1.样品制备: 从辣根组织中提取辣根过氧化物酶。可以使用适当的提取缓冲液(如磷酸盐缓冲液)将辣根样品研磨或切碎，并离心以获得澄清的提取物。

2.蛋白质定量: 使用合适的蛋白质定量方法(如Bradford法、Lowrv法或BCA法)确定提取物中的蛋白质含量。

3.样品前处理: 根据实验需求和已有的文献方法，可能需要对提取物进行一些前处理步骤例如蛋白质分离、富集或去除干扰物。

4.HPLC条件设置: 选择适当的HPLC系统和柱，并根据同工酶C的特性设置合适的分离条件，如流动相、梯度条件、流速等。也可以参考已有的文献方法进行条件设置。

5.样品注射: 将前处理后的样品以适当的注射体积注入HPLC系统中

6.检测和分析: 使用合适的检测器

操作步骤

（一）HRP的制备

⒈水提取：

称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根（辣根皮中亦含有丰富的HRP），用菜刀切成小碎块，在搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜。次日用甩干机甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次，合并两次滤液，量总体积和度。

⒉硫酸铵分级分离：

在不断搅拌下，每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末（相当于0.40饱和度），大约在1~2小时内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面浑浊液以3000转/分离心15分钟，弃沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末（0.8饱和度）随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13000转/分离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸馏水中（加水量要使沉淀全部溶解为止），分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析1~2天，直到硫酸铵透析完毕为止（可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查）。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。

将透析液合并，在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟；去沉淀，量上清液的体积。

⒊丙酮分级分离：

将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4，000/分离心15分钟，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积（按原上清液体积）-15℃丙酮，（操作同上），静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。

⒋精制：

将上步酶液适当稀释，滴加1M硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3M，5000转/分离心10分钟，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，对水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冷冻干燥（约得20毫克），产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的Rz值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。

HRP的活力测定

测定过氧化物酶的传统方法是连苯三酚试验法，以过氧化氢为底物，在酶作用下，连苯三酚可形成红棓酚（Purpurogallin），在430nm处测定产物的形成。用红棓酚值（PZ）表示酶的活力。PZ表示在标准测定条件下1毫克酶所形成的红棓酚微克数。

要使用HPLC法测定辣根过氧化物酶中同工酶C的含量，你可以按照以下步骤进行：

1. 样品制备：从辣根组织中提取辣根过氧化物酶。可以使用适当的提取缓冲液（如磷酸盐缓冲液）将辣根样品研磨或切碎，并离心以获得澄清的提取物。

2. 蛋白质定量：使用合适的蛋白质定量方法（如Bradford法、Lowry法或BCA法）确定提取物中的蛋白质含量。

3. 样品前处理：根据实验需求和已有的文献方法，可能需要对提取物进行一些前处理步骤，例如蛋白质分离、富集或去除干扰物。

4. HPLC条件设置：选择适当的HPLC系统和柱，并根据同工酶C的特性设置合适的分离条件，如流动相、梯度条件、流速等。也可以参考已有的文献方法进行条件设置。

5. 样品注射：将前处理后的样品以适当的注射体积注入HPLC系统中。

6. 检测和分析：使用合适的检测器（如UV检测器或荧光检测器）进行同工酶C的检测，并记录峰的面积或高度。根据已有的标准曲线或其他定量方法，将峰面积或高度转化为同工酶C的含量。