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科研学霸天团，48小时有问必答

问提高蛋白质纯化的成功率有什么好的经验分享？

一个小哭包

蛋白质纯化工艺中的其他因素也会对蛋白质的稳定性产生影响。对蛋白质的处理步骤越少越好，在最短时间内采用最少步骤的纯化工艺才能保证得到最高产率的活性蛋白质。而且，在整个纯化过程中，蛋白质最好都保持在低温状态。一般纯化过程都在4°C进行,因为这个温度既可以降低酶解速度（在含有蛋白酶的情况下），又可以保证蛋白质的结构完整性。

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问怎样增加蛋白样品的稳定性？

雨婷42B1

尽量减少保存蛋白的反复冻溶，可以将提取的蛋白少量分装于离心管，用时取出即可。

4 回答174 围观

问细胞水平要做 Western Blot，一般需要多少量细胞提取的蛋白就够了？

实验菜狗lmd

主要和你的细胞大小，蛋白表达情况有关，细胞比较大，或者蛋白属于微量蛋白，那最好三个孔（6孔板）

4 回答386 围观

问如果目标蛋白是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂应如何调整？

Eason老歌迷

最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

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问蛋白变性后，如何可以提高保存时间？

书香雪峰

蛋白质可以保存在-20度或-80度中，避免反复冻融

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问脱脂奶粉中含生物素，如果实验中有涉及到“生物素”时需要注意什么？

bamboopiggy

脱脂奶粉中含有少量的生物素和碱性磷酸酶残留，在使用生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时，也会产生高背景或使得本底水平增高。

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问一抗，二抗的比例是比较重要，怎样调整好一抗，二抗的比例？有没有经验分享一下，谢谢

bamboopiggy

一般，拿到一抗就先1：1000 试一下，如果浅就改1：500.如果深，就改1：2000，基本差不多，二抗，问卖给你的公司，他们一般有个参考值，有的1：4000，有的1：1-2万。

3 回答132 围观

问抗体工作溶液可以储存反复使用吗？

bamboopiggy

看你用的频率，如果每天都用，至少可以反复用三次，如果不是每次都用，可能一周左右还是可以再用的。

3 回答150 围观

问转膜液加甲醇的目的是什么？

bamboopiggy

甲醇加到转移缓冲液中主要有两种作用:1.稳定凝胶的大小,2.除去与蛋白质分子复合的SDS.

3 回答2349 围观

问电泳时 Marker 总跑不全所有条带，即使用增大胶浓度仍不全？

bamboopiggy

一般用10-180kd的marker，在10%的胶上是可以跑全的，看你的实验目的，不行可以买预制胶，有梯度胶，显示所有的marker在10180之间。

3 回答97 围观

问WB结果用imagej统计灰度值时降背景是必须的吗？

Eason老歌迷

正常的流程，是必须要降背景的。你要是想不弄，你可以试一试先，看看得出的结果可不可行。

3 回答217 围观

问肽段进质谱主要断的是什么键，形成哪些碎片离子？

Eason老歌迷

肽段在质谱中的碎裂有一定的规律，肽段母离子在质谱仪的碰撞室经高流速惰性气体碰撞解离，肽链在酰胺键出断裂并形成子离子，差生a、b、c型和x、y、z型系列离子。a、b、c型离子保留肽链N端，电荷留在C端；x、y、z型离子离子保留肽链C端，电荷留在离子N端。其中b型和y型离子离子在质谱图中较多见，丰度较高。y、b系列相邻离子的质量差，即为氨基酸残基质量，根据完整或互补的b、y系列离子可推算出氨基酸序列。

4 回答448 围观

问用50mMHEPES，含4%SDS的裂解液裂解细胞得到的是细胞表面蛋白质吗

Eason老歌迷

总蛋白。得到的蛋白可以用来电泳，

3 回答71 围观

问如何提取细胞表面蛋白质呢？

bamboopiggy

去买一个试剂盒，可以直接提，可以去thermo的官网看看，好多可以用的试剂盒，便宜的碧云天有。

3 回答259 围观

问犬埃立克体virb9基因的表达

Eason老歌迷

是不是，实验中某个步骤没有做好呢？回顾检查一下。

3 回答74 围观

问关于APSite问题？

Eason老歌迷

两者原理并不一样。对ssdna并无作用。不能。

3 回答154 围观

问做WB时一抗洗完一定要马上敷二抗吗？

府宅

要立马敷二抗，如果不洗，一抗可以过夜，但洗完之后就要马上敷二抗，要不会影响结果

6 回答917 围观

问免疫共沉淀coip中的同型对照怎么选

洛噜啦噜啦嘞

免疫共沉淀coip中，建议以2a为主。

6 回答196 围观

问如何选择表达出蛋白的WB抗体？

科拜余萌

WB实验中使用到的有三种抗体：一抗、二抗和内参抗体。一抗是唯一针对目标抗原的抗体，可以进行制备也可以购买现货，难度系数较高；二抗直接买就OK，只是需要留意下种属选择；内参抗体必不可少，是WB实验中的质控环节。 WB检测之一抗一抗制备如果目的蛋白的现货抗体没有找到，或者都不中意，就需要亲自动手制备了，请公司帮你做也不错哦！自己制备一抗通常情况下可以选小鼠、兔制备多抗或者选小鼠制备单抗，前者省时省

6 回答230 围观

问MS1和MS2两个谱图的区别有哪些

天一湖医者

MS1信息的准确性，取决于很多因素，比如色谱的喷雾足够稳定、样品的纯净度高，严格控制污染等等，这些条件都满足了，才能得到比较完美的一级定量信息，这对后续的定性定量分析都会有帮助。样品的前处理和质谱的维护这两个关键的因素，一定要把握好，如果有影响，那么在后续的数据分析中，任何统计方法搜库方法都无法挽回先前的污染信息。MS2简单讲就是将一条完整肽段送入质谱进行打碎之后得到的信息。我们的碎裂过程一般来说

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