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科研学霸天团,48小时有问必答
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WB条带
小小小小小芳
电泳缓冲液用的次数过多,一般来说电泳缓冲液用过两次以后电泳的效果就会变差
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干细胞诱导分化出现的问题
申东熙老伯
会受代数影响,建议使用传代次数小一些的干细胞。
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加药处理细胞后wb结果不呈趋势
cq2019
我觉得这个问题其实复杂,包括客观因素和主观因素。客观上讲,不同批次的细胞不同状态的细胞都有可能出现表达量不一致的情形,此外实验条件和样本的浓度,加样的量都会有误差;主观上来说,个人操作的原因,不同批次出的结果可能由于人的操作出站差异,我的习惯是可以同一批次一般不同的人同时做这个实验。
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问
基质金属蛋白酶WB求助
小小小小小芳
样品处理中使用的设备或缓冲液应在冰上(4 ℃)冷藏保存。尽可能使用预冷的试剂和设备,可以减缓去磷酸化、蛋白水解和变性。在裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂,否则轻者条带不明显,重者没有条带。最好是添加新鲜配制的蛋白酶-磷酸酶抑制剂混和物,蛋白定量后,将样品与上样缓冲液混合,遏制磷酸酶活性。随后可以将样本等分并储存在冰箱中或加载到凝胶上。
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问
请问WB条带怎么跑出来是这样的呢
balalaLy
有没有可能是你的蛋白表达出了问题?比如诱导表达是不是成功?蛋白表达后是位于哪里?
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小分子蛋白总是波浪状条带!!求大神给个解决方法!!
balalaLy
LC3B就是一个条带的呀,LC3a/b才有两条带。波浪形可能是跑得太下了
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wb曝光
灵枢天问
你这个曝光左右两边红色的是什么?marker应该不发光吧,我觉得是机器设置没调对
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问
条带散开了,是什么原因吖,分子量52,80V跑全程,200mA1.5h湿转,四个带一起的,只有这一个这样子
balalaLy
看着有点像是转膜的夹子夹太松了。
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WB检测不到多种细胞内BRD4的表达
汤姆卜丽波
这种情况你可以把显示不出来的再一起做一遍,就能看出来到底是表达不高还是不表达
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LC3 western的条件!!!
bamboopiggy
用15%的胶,不能全部下去,在大概中间偏下的位置就可以了,别非要跑到胶的底部。转膜的条件 没有问题,我用的是abclonal的抗体,两条带都能出来。
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western操作问题
申东熙老伯
洗膜的时候可以放在一个盒子里,孵二抗的时候取决于你的两个蛋白抗体是什么抗什么。
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WB实验投稿样本的重复性问题?
bamboopiggy
细胞是三次收样,跑三次胶得到三个结果。动物实验是每组至少五个,跑一次就可以。
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55-72kd的杂带,还有34kd那里的杂带。真是哭了最近每次做都是这个杂带。原本只有72那条,昨天出现了34那条,今天两条一起
申东熙老伯
抗体浓度是多少?有杂带说明抗体特异性不好,降低浓度试试。
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求助!蛋白挂不上离子交换柱
汤姆卜丽波
把柱子再生一下试试,是不是用了有一段时间了
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western blot跑胶时样品涣散
汤姆卜丽波
上样量估计有点大,这种情况浓缩胶就该多配一点
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不连续的蔗糖密度梯度纯化外泌体离心后不分层
Dr_劉医生
蔗糖密度梯度离心法是目前提取外泌体应用较多的方法,将细胞混合悬液或匀浆置于蔗糖介质的顶部,通过离心力的作用使细胞分层、分离,将外泌体从混杂物质中分离出来,然后使用滤膜进一步纯化(具体步骤见图)。蔗糖密度梯度离心法获取的外泌体纯度高,已作为药物载体用于临床试验。但前期准备工作繁琐,操作复杂耗时长,获得的外泌体数量却不多,而且可能会因梯度溶液高渗而导致亚细胞水分丢失,进而影响外泌体的生物学功能。这两篇
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wb结果成这样是什么原因呢?一共4个孔,第二个孔条带很弱,其他孔都不成条带,要么是黑坨坨,要么就像第四个孔条带只有半截
bamboopiggy
感觉你第三个孔很好,第一个孔是蛋白浓度稍微有点高,成团了,二应该就是表达量低。但是四可能是你转膜没有转好。
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求问如何做跨膜蛋白和胞质蛋白互作的coip?
汤姆卜丽波
只需要分离膜蛋白,胞质蛋白不用分离出来,然后按照普通coip的流程做就可以了
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为什么我的WB跑的时候是波浪!
lagrimaOI9K
制胶不均匀,有没有可能,板子没刷干净呀~可以考虑浓缩胶稍微多一点
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蛋白棕榈酰化
Dr_劉医生
之前听过拜谱的工程相关的讲座,棕榈酰化修饰蛋白组现在也是比较前沿的技术,相信文献你也找到过,我也附上几篇综述;主要因为技术路线都涉及质谱等仪器,导致很多实验操作都很难,可以去咨询相关生物科技公司,外包或者请教他们一下;参考文献:[1] Main A, Fuller W. Protein S‐Palmitoylation: Advances and Challenges in Studying a
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