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小小小小小芳
样品处理中使用的设备或缓冲液应在冰上（4 ℃）冷藏保存。尽可能使用预冷的试剂和设备，可以减缓去磷酸化、蛋白水解和变性。在裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂，否则轻者条带不明显，重者没有条带。最好是添加新鲜配制的蛋白酶-磷酸酶抑制剂混和物，蛋白定量后，将样品与上样缓冲液混合，遏制磷酸酶活性。随后可以将样本等分并储存在冰箱中或加载到凝胶上。
姚垚垚垚
提蛋白全程冰上进行的，用的不含EDTA的RIPA+蛋白酶磷酸酶抑制剂，样本也没有煮，用的是非变性非还原的loading，上样量20ug，制备8%的无SDS的胶，用无SDS的PAGE电泳，然后转膜1.5h，用的快速封闭液封闭的，abcam的抗体1：5000稀释过夜孵育，二抗是CST的，用商品化的抗体稀释液稀释的，中间都是洗膜三次，直接曝光的全膜，但是就是没有条带，干干净净一张白纸😭
灵枢天问
如果很多次都跑不出来那最有可能出问题的就是抗体，抗体没选对
姚垚垚垚
提蛋白全程冰上进行的，用的不含EDTA的RIPA+蛋白酶磷酸酶抑制剂，样本也没有煮，用的是非变性非还原的loading，上样量20ug，制备8%的无SDS的胶，用无SDS的PAGE电泳，然后转膜1.5h，用的快速封闭液封闭的，abcam的抗体（货号ab76003）1：5000稀释过夜孵育，二抗是CST的，用商品化的抗体稀释液稀释的，中间都是洗膜三次，直接曝光的全膜，但是就是没有条带，干干净净一张白纸😭
bamboopiggy
普通的wb跑法没有问题，但是我记得我用的抗体是abclonal的，你实在不行就跑个全膜看看，是不是位置有改变，你没有切到。
姚垚垚垚
我跑的是全膜，样本没有煮，用的是非变性非还原的loading，上样量20ug，制备8%的无SDS的胶，用无SDS的PAGE电泳，然后转膜1.5h，用的快速封闭液封闭的，abcam的抗体1：5000稀释过夜孵育，二抗是CST的，用商品化的抗体稀释液稀释的，中间都是洗膜三次，但是就是没有条带，干干净净一张白纸😭
