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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
实时荧光定量PCR 的引物能不能用来做RT
dxy_j7jezao0
下游引物可以,这就是RT中所说的特异引物
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问
荧光定量PCR熔解曲线出现多峰是什么原因?怎么解决?
bamboopiggy
一般情况是引物不特异,可能有多个产物。不能用,换个引物。
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问
PCR实验中菌落PCR检测有条带,接种大摇后无条带
bamboopiggy
一般菌落pcr,可能会存在插入片段也转入菌种,但是没有和载体连接成功。所以一般做完菌落pcr以后,先要送测序,测序成功,才大摇比较合适。
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问
PCR实验中扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
bamboopiggy
可能产物不特异,出现多条带,但是片状弥散,可以考虑灌胶不匀,尤其是在胶中直接加入EB或GV的情况下
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问
请问 PCR引物长度24点情况下,错配几个碱基仍能P出来、基本不影响效率?
dxy_j7jezao0
不确定,引物特异性主要受3'端序列影响,错配在5'端,影响较小。
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问
如何针对致泻性大肠ETEC的stp和sth基因设计特异性强且有效的引物和Taqman探针?能够使Ct值小一点,荧光强度值大一点
Miracle星
1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2、引物GC含量一般为40%-60%, 45-55%为宜,GC含量过高或过低都不利于引发反应,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近,一般Tm值不超过5℃。3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间,最好为72℃左右。4、引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修
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问
跑qPCR,内参基因和目的基因CT值正常,结果也比较理想,但内参基因熔解曲线呈较宽的单峰,Tm比目的基因熔解曲线低很多,有效吗?
bamboopiggy
看图,感觉两个melt curve 底边是一样宽的,但是你如果觉得内参基因的宽,可以考虑换一个大家常用的内参基因试试,一般情况,内参基因不会出现这种问题。
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问
qRT-PCR模板稀释比例一般为多少啊?
cq2019
我都是按照1:5的比例来稀释,跑出来的结果非常好
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问
如何判断pcr仪器的样本加热模块是否被污染啊?
bamboopiggy
从你做出的结果分析,如果有个孔漂的太厉害,要么是热盖的问题,要么就是孔被污染了
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问
求问qPCR的引物如何设计,一般选择哪段序列,探针法和燃料法有什么区别?
Eason老歌迷
我们聊一聊探针法和染料法的区别。通过探针可以增加反应的特异性,只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号,能够预测和提前进行反应条件的优化,它的缺点是要合成探针,成本比较高。染料法呢比较经济,可以做溶解曲线,分析全部PCR产物的M值,缺点就是特异性没有探针法高。
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问
定量Pcr时候怎么减少加样导致的误差
cq2019
为了尽量减少由于加样导致的误差,可以把混合液加完后,最后再加cDNA,加的时候枪头不要深入液体面,同时每加一个孔都要换枪头,最后2000r/min离心
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问
PCR结果中,二聚体太亮怎么办
bamboopiggy
你这除了二聚体,看不到条带啊,你可以试试降低引物的浓度,但是是感觉你引物之间的结合影响了你引物和模板的结合
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问
已经逆转录之后的cdna,化冻以后上样扩增之前可以涡旋吗?
cq2019
cDNA还是比较稳定,可以瞬时涡旋震荡的
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问
扩增厚的产物在电泳时有时没有条带或者有的很浅怎么破啊?
bamboopiggy
可能是你的pcr程序不合适,实在不行,先做个touch down吧,然后再扩增
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问
pcr操作过程怎么能避免各种酶的污染呢?特别容易被污染
bamboopiggy
pcr过程中的污染,主要是气溶胶,dna的污染,注意规范操作
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问
请问细胞基因测序得结果准确吗?为什么我跑出来pcr验证结果确是相反的?
bamboopiggy
seq的结果,不同公司分析的都会不一样,所以仅供参考,还是需要qpcr验证一下
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问
设计引物,普通PCR条带弱,QPCR出现双峰是什么原因?
bamboopiggy
说明设计的引物不特异。有非特异性结合
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问
PCR琼脂糖凝胶电泳,如何能跑一条干净的条带?
bamboopiggy
模板杂质少,琼脂糖凝胶融的好,引物特异。
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问
PCR如何减少二聚体及非特异性产物?
Eason老歌迷
你可以从下面几个原因里找出对策:重新设计你的引物;也有可能模板有问题;你的模板浓度过小,适当加大模板量;你的Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高;取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的;若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别,则考虑Buffer
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问
PCR实验过程中产物在凝胶上呈Smear状态拖尾怎么办
丁香木木
提高退火温度、重新设计引物、提高特异性
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