引物设计的Tm值和qpcr结果显示测得的Tm值不一致，这是为什么

引物TM是设值和合成引物时的Tm值,也就是理论值。而PCR产物tm值是在实际操作中摸索出来的温度值

引物Tm值与PCR产物Tm值这两个不同的引物当然退火温度也不相同,一般在设计引物的时候,程序就会显示出Tm值是多少.在做PCR的时候,将退火温度设定的稍微低于Tm值一点,降低引物的特异性,可能会好点.

当然,做PCR有一定的运气成分,同样的条件有时能扩出基因来,有时候却不能.一般来说,一直无法P出基因的话,首先就要检查引物设计是否有问题,如果没有问题,或者以前P出来过.那么检查下退火温度,多试几个温度.再就是Mg离子的浓度,模板不要太多.多尝试一下.

总之,设定退火温度的时候略微比Tm低一点,适当的调整,多多尝试,就好了.

我也有一次遇到这个问题，技术说，可能扩出来的不是目的基因。。

Tm值是半数退火温度，Tm值在50-60引物与模板结合状态较好，也就是理论值。而PCR产物tm值是在实际操作中摸索出来的温度值。引物Tm值与PCR产物Tm值这两个不同的引物当然退火温度也不相同,一般在设计引物的时候,程序就会显示出Tm值是多少.在做PCR的时候,将退火温度设定的稍微低于Tm值一点,降低引物的特异性,可能会好点。