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科研学霸天团,48小时有问必答
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ROS胰酶选择
秋秋欣欣
影响不大,但是如果你细胞好消化的话最好还是用不含的
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问
利用CRISPR进行基因敲除能不能敲除第一个外显子即ATG所在的外显子
bamboopiggy
这个技术上是可以敲掉的,但是一般进行基因敲除会从二号外显子开始进行。
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问
病毒滴度的测定有哪些方法,什么原理
汤姆卜丽波
可以用稀释计数法,不同稀释比例的量去感染细胞然后镜下计数,在计算病毒滴度
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问
求助 我插入的目的片段是1000多的,但是PCR完跑胶条带位置在800-1000左右,而且感觉拖带严重,这是为什么呀
Eason老歌迷
如果你插入的是1000多,但是pcr跑完是800-1000,可能是发生了dna断裂或者是你酶切的不对。而你的电泳缓冲液浓度过高,或者跑胶的电压过大都会导致拖尾现象。
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问
【求助】请教电泳时加样误加到内槽里会不会有影响
Eason老歌迷
对你的其他条带没有啥影响,但是你这个加样孔的结果就不准确了啊,因为要控制每个孔加样体积要一致。
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问
刚刚接触免疫共沉淀,向各位老师请教这个图怎么看,谢谢!
balalaLy
MG132是防止相互结合的蛋白解聚,his-ub是加了his标签的泛素化蛋白,主要看后面两个孔的IP条带,usp26可以抑制b-catinin的泛素化
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问
师姐给我了2管菌液,一个标记着目的片段的菌液,另一个
Topmicro
真核表达载体的制粒用哪个?两管都含有目的片段,只是链接的载体不一样而已,需要考虑你真核表达载体来确定。
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问
看文献看到免疫共沉淀的图,这个结果分析怎么看,谢谢!
Eason老歌迷
教你一个办法,可以看懂所有的coip图,
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问
miRNA与靶基因同时过表达,蛋白怎么变?
balalaLy
很少有人这么做的吧,一般都是miRNA和靶基因一正一反分别做。
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问
质粒构建相关问题
Eason老歌迷
无外乎2个关键点:1.载体和片段,载体在进行酶切时要切干净,做对照,单切一定要cip,不然切的好也是白搭;做连接转化时要做自连对照,看下转化子和自连的菌落数大概心里就有个概念连上没连上了;连接片段是酶切得来就可以直接连,把胶回收产物再跑个胶看看,有时候我觉得光测不是特别准,一般片段不会有特别大问题;2.连接体系,个人觉得一次连接那么费时间,可以适当拉开比例做几个连接,然后一起进行转化。
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问
求助|请教基因如何表达
Topmicro
软件会从你插入的起始密码子处开始显示。
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问
肿瘤中sh基因干涉,顺转能干涉下去但是稳转之后没有效果怎么办
Eason老歌迷
如果顺转可以干涉下去,说明还是有作用的,你可以换一种转染试剂,我们实验室之前换了转染试剂,Knockdown效率一下子提高到95%以上。
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问
CTAB法提取真菌DNA,两次跑胶结果如图,请问是什么原因?
Eason老歌迷
感觉你提的不太好。一个是水浴的时候要注意摇晃,10min一次,很关键。还有加氯仿异戊醇后要充分混匀,一般在振荡器上晃30min。你用的异丙醇要提前放在-20的冰箱里。实验中每步都要剪枪头,以免弄断DNA。
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问
pDONR221质粒酶切不完全求助
Eason老歌迷
可能是你的酶切时间有些长,因为定性试验,产物的量不甚准确,建议将酶的量做一个梯度,但不是将酶浓度稀释。或者是镁离子浓度可能有些不适合,建议做一下调整。
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问
琼脂糖电泳跑出的条带怎不是那么好看,谁有高招?
锟1112
充分融化琼脂糖,提高浓度,降低电压,把染料加在产物里(部分染料可用)
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问
In-fusion反应液可以直接PCR验证吗
Eason老歌迷
可以!你要是p不出来,可以加点Cloning Enhancer,消除了PCR反应液中引物二聚体和dNTP等的影响试一试,我是可以p出来的。
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烟草脆裂病毒TRV VIGS求助
Eason老歌迷
感觉是不是你的注射浓度量有点大?刺激到了叶片
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问
如何寻找某基因的启动子序列 以及起始密码子ATG ?
Eason老歌迷
获取目的基因的 mRNA 序列,并且在 NCBI 的数据库中查获转录起始点截取转录起始点为中心,上下约各 1000bp,若在此范围内出现 CDS,可到翻译起始点终止利用在线软件进行分析 PromoterInspector。
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问
同源重组的引物退火温度该如何计算
Eason老歌迷
退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5~知8) 只是粗算,有时不灵,但比道较简便。或者用primer5(or oligo6)计算,引物配对好后,primer5可以显示Tm,我认为这个值就是退火温度,我的经验再加2 or 3度最好。你的合成引物的单回子上也有个Tm,减去5~8也可。
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问
是引物二聚体吗
idiotOC0P
最下面那坨边缘不清晰的是引物二聚体
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