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基于化学物质 ENU 的随机诱变技术
ENU 是一种烷化剂,它能在 DNA 上将乙基传递给氧或氮基,导致碱基错配或替换(主要诱发点突变,即在 A-T 碱基对替换)。ENU 已被成功地用于获取单基因的各种等位基因。这些措施包括等位基因功能,亚效等位基因功能的缺失,并获得功能突变。在单个位点等位基因系列进一步确定基因功能上是非常强大的。此外,表型驱动的 ENU 筛选提供了解析发育和生化途径的工具。
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基因捕获技术
基因捕获(gene-trap)突变是一种随机产生功能缺失突变并报告基因表达,以及捕获感兴趣基因的技术。其专门为发现基因的一种工具,无论基因是否有转录活性都可以被捕获。因基因捕获易于鉴定,克隆和基因变异而在脊椎动物的发育和细胞生物学中非常重要。目前已开展了多个大规模基因捕获筛选项目,其使用了多种新的载体以产生突变 ES 细胞的公共资源库。
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基于 RNA 干扰的动物基因敲低技术
RNAi 是一种通过体内的剪切形成小的(大约 21nt)双链 RNA,而其中的反义链与靶向基因的转录本互补,形成的双链结构介导持续的靶向基因的降解,从而使得靶向基因沉默。与基因敲除相比,RNAi 介导的基因沉默更加快速,节约高效,其广泛地被用于功能基因组的研究,也非常适应研究广泛生物的同源基因。
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iPS细胞制备技术
诱导性多潜能干细胞(iPS 细胞)是具有形成人和动物个体所有类型细胞的多向分化潜能并自我更新的一类细胞。iPS 细胞不仅可以表现为类 ES 细胞的特性,还避免了 ES 细胞的伦理道德问题,解决了多潜能性细胞的来源问题;避免了免疫排斥,为发育生物学以及组织器官构建的研究工作提供了模型;为研究特异性疾病的药物治疗提供了检测数据,对提高药物的效价、降低药物对机体的毒性等方面具有深远意义。
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基于 CRISPR/Cas9 系统的动物基因敲除技术
CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated system)存在于大多数的细菌和几乎所有的古细菌中,是细菌在进化过程中形成的一种免疫防御机制,以帮助细菌抵御外来病毒和 DNA 的入侵。其中 Cas9(CRISPR-associated protein 9)具有用于基因操作
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TALEN 敲除基因
与传统通过同源重组实现基因敲除方法不同,利用 TALEN 技术是通过 NHEJ 修复方式进行模式动物的靶向基因敲除,不需要进行 ES 细胞的操作。只要将 TALEN 的 mRNA 显微注射到模式动物受精卵中,可实现直接基因敲除。由于不同的模式生物,铺助生殖技术的不同,使用 TALEN 敲除基因的方法也有所不同。主要是下面两种方式:①受精卵显微注射 TALEN mRNA 敲除基因;②TALEN 结合
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TALEN 的活性检测
TALEN 质粒构建好后,在进行动物或细胞操作前,最好检测其活性,确保 TALEN 的有效性,及减少后续筛选突变体的工作量,TALEN 活性越高,后续的筛选突变体的工作量越少。常用的检测 TALEN 活性的方法有以下 3 种:luciferase SSA 法、非配对内切酶法-T7E1 法和限制性内切酶法。
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TALEN 的组装构建
TALE 蛋白的特异 DNA 序列识别以及灵活的可组装性为它们在分子生物学中的应用提供了巨大的前景,针对任意序列的靶 DNA,科学家们可以设计组装任意的 TALE 单元结合目标 DNA 双螺旋序列。如果将 TALE 的 DNA 结合区域和其他功能性结构域构建成融合蛋白,则可以发挥更广泛的作用。TALEN 的组装构建方法有磁珠载体 TALEN 组装构建法、TALEN 单元组装法构建法、TALEN 多
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嵌合体实验分析ES细胞分化潜能
常规的通过嵌合体技术检测 ES 细胞全能性的方法是将 ES 细胞注射到正常二倍体胚胎的囊胚腔,获得嵌合体动物后再进行杂交,获得 ES 细胞的种系传递。这种方法结果很稳定,效率也很高,是检测干细胞全能性和制作基因打靶小鼠的常规技术。但是,由于需要对获得的嵌合体小鼠进行杂交选育才能确定其是否能够实现种系传递,所需的时间比较长,操作比较烦琐。在制作基因打靶小鼠时,需要分别获得雌性和雄性的嵌合体小鼠,然后
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小鼠胚胎干细胞分化潜能检测
除在体外有无限传代的功能之外,ES 细胞的另外一个显著特征是其在体内和体外适当条件的诱导下分化为多种有功能的细胞,检测小鼠胚胎干细胞的方法主要包括:体外分化、体内分化-畸胎瘤实验以及检测 ES 多能性的嵌合体实验。
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鲍曼不动杆菌感染动物模型
鲍曼不动杆菌 (Acinetolacter baumannii)为不发酵糖类的革兰氏阴性球杆菌,广泛分布于自然界。 医院及人体皮肤,属于条件致病菌, 可引起肺部感染,泌尿道,皮肤软组织,中枢神经系统等多部位感染及败血症。近年来,其所致院内感染率。包括碳青霉烯类抗菌药物在内的抗菌药物耐药率均呈上升趋势,因此构建鲍曼不动杆菌感染动物模型对探讨其致病及耐药机制具有重要意义。由于鲍曼不动杆菌易侵及肺组织,
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小鼠染色体重组技术
同源重组(homologous recombination)是遗传重组的一种类型,是指两条相似或相同的 DNA 链之间发生核酸序列的交换而引起 DNA 重新排列。这个过程包括 DNA 的断裂和重新连接等若干步骤。尽管同源重组常常对 DNA 双链的断裂起到修补的作用,但其也会介导减数分裂时染色体交换而产生重组 DNA。这些由于同源重组而产生的突变,是生物体适应环境变化的一种有效方式。DNA 同源重组
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基于胚胎干细胞同源重组的基因敲除技术
同源重组是遗传重组的一种类型,是指两条相似或相同的 DNA 链之间发生核酸序列的交换而引起 DNA 重新排列。这个过程包括 DNA 的断裂和重新连接等若干步骤。尽管同源重组常常对 DNA 双链的断裂起到修补的作用,但其也会介导减数分裂时染色体交换而产生重组 DNA。这些由于同源重组而产生的突变,是生物体适应环境变化的一种有效方式。基因敲除(gene knock-out)是通过一定的途径使机体特定的
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通过重组逆转录病毒(慢病毒)载体感染制备转基因动物
慢病毒载体是近几年发展起来的新型转基因载体。慢病毒属逆转录病毒的亚科,慢病毒载体经结构改造后,不在宿主细胞内增殖,也不会导致寄主细胞的死亡,受感染动物细胞能正常连续传代,其最大的优势在于既能感染静细胞也可感染分裂期细胞,而且感染率极高。
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细菌人工染色体转基因动物技术
人工细菌染色体(bacterial artificial chromosomes,BAC)是可以克隆外源大片段 DNA 的载体系统。主要由 redF(F 因子基因)和 Ori2 序构成的复制子以及其他调控序列组成。BAC 复制受到严格的控制,因此在 Ecoli 内保持单拷贝或低拷贝。BAC 克隆的 DNA 片段可以达到 1 Mb(平均约 200kb)。加上 F 因子遗传稳定,并且无缺失、重组和嵌合
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体细胞核移植技术制备转基因动物
核移植是指将胚胎细胞或成体细胞细胞核利用显微外科手术的方法移入去核卵母细胞,构建成重组胚胎,经过一段时间的培养,移植到代孕受体体内,产生与供体细胞相同基因型后代的技术过程,又称之为动物克隆技术。
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显微注射技术制备转基因动物
DNA 显微注射的基本过程是将线性化的 DNA,利用显微注射仪,通过注射针将外源基因注射到受精卵的雄性原核中,然后将含有外源基因的受精卵移植到假孕雌性动物的输卵管中,产生转基因动物。DNA 显微注射法是目前最常用、最经典的导入外源基因的方法之一。
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铜绿假单胞菌感染动物模型
铜绿假单胞菌 ( pseudomonas aeruginosa ,PA) 为条件致病菌,广泛分布于自然界,常定植于人和动物的上呼吸道、消化道、皮肤及尿道等部位。近年来,PA 成为医院获得性肺炎的最重要致病菌之一,故对其所致肺部感染的发病机制,病原学、治疗等方面的研究成为热点。因此,成功构建铜绿假单胞菌感染肺炎动物模型具有重要意义。
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金黄色葡萄球菌感染动物模型
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus,SA) 为革兰阳性球菌,主要定植在人体皮肤表面,亦可引起各种感染,包括皮肤软组织感染、败血症、心内膜炎、肺炎、肠炎、脑膜炎、骨髓炎及中毒性休克综合征等。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA) 感染被列为世界范围内三大最难解决的感染性疾患之一。国内外广
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小鼠胚胎干细胞的鉴定
干细胞(stem cells)是具有自我更新能力的多潜能细胞。根据其发育潜能,干细胞被分为 3 类,即:全能干细胞(totipotent stem cell),多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stemcell)。在适宜的条件下,动物多能干细胞具有分化为身体各种细胞的潜能,在基础研究、医疗、药物研发等方面具有不可估量的应用价值。与此同时,干细
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