基于 CRISPR／Cas9 系统的动物基因敲除技术

CRISPR／Cas9 系统的原理是 Cas9 是一种内切酶，其具有 RuvC 和 HNH 两个内切酶活性中心。研究表明 Cas9 在细菌和试管里对双链 DNA 具有强烈的切割能力，但是这种切割能力需要两种小 RNA 介导-crRNA（CRISPR RNA）和 tracrRNA（trans-activating crRNA）。tracrRNA5＇端的序列和 crRNA3＇端的保守序列通过碱基互补配对形成一个杂交分子，这个杂交分子通过其特殊的空间结构和 Cas9 相互结合形成一个蛋白-RNA 复合体，这个复合体通过 crRNA5＇端特异性的 20 个碱基与目标 DNA 相结合，复合体中的 Cas9 通过其两个内切酶活性中心切断双链 DNA，其中 HNH 活性中心切断与 crRNA 互补的一条链，RuvC 活性中心切断非互补链（图 5-2-22b）。蛋白-RNA 复合体对 DNA 的切割活性还依赖目标 DNA 上存在 PAM（protospacer adjacentmotif），PAM 一般指 NGG 序列，GG 两个碱基中的任何一个发生突变，都会导致蛋白-RNA 复合体切割活性的降低甚至丧失。