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基于 CRISPR/Cas9 系统的动物基因敲除技术

实验分类:

实验动物

最新修订时间:

简介

CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated system)存在于大多数的细菌和几乎所有的古细菌中,是细菌在进化过程中形成的一种免疫防御机制,以帮助细菌抵御外来病毒和 DNA 的入侵。其中 Cas9(CRISPR-associated protein 9)具有用于基因操作的潜在可能。

原理

CRISPR/Cas9 系统的原理是 Cas9 是一种内切酶,其具有 RuvC 和 HNH 两个内切酶活性中心。研究表明 Cas9 在细菌和试管里对双链 DNA 具有强烈的切割能力,但是这种切割能力需要两种小 RNA 介导-crRNA(CRISPR RNA)和 tracrRNA(trans-activating crRNA)。tracrRNA5'端的序列和 crRNA3'端的保守序列通过碱基互补配对形成一个杂交分子,这个杂交分子通过其特殊的空间结构和 Cas9 相互结合形成一个蛋白-RNA 复合体,这个复合体通过 crRNA5'端特异性的 20 个碱基与目标 DNA 相结合,复合体中的 Cas9 通过其两个内切酶活性中心切断双链 DNA,其中 HNH 活性中心切断与 crRNA 互补的一条链,RuvC 活性中心切断非互补链(图 5-2-22b)。蛋白-RNA 复合体对 DNA 的切割活性还依赖目标 DNA 上存在 PAM(protospacer adjacentmotif),PAM 一般指 NGG 序列,GG 两个碱基中的任何一个发生突变,都会导致蛋白-RNA 复合体切割活性的降低甚至丧失。

来源:丁香实验团队

操作方法

基于 CRISPR/Cas9 系统的动物基因敲除技术

CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated system)存在于大多数的细菌和几乎所有的古细菌中,是细菌在进化过程中形成的一种免疫防御机制,以帮助细菌抵御外来病毒和 DNA 的入侵。其中 Cas9(CRISPR-associated protein 9)具有用于基因操作

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