简介
CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated system）存在于大多数的细菌和几乎所有的古细菌中，是细菌在进化过程中形成的一种免疫防御机制，以帮助细菌抵御外来病毒和 DNA 的入侵。其中 Cas9（CRISPR-associated protein 9）具有用于基因操作的潜在可能。
原理
Cas9 是一种内切酶，其具有 RuvC 和 HNH 两个内切酶活性中心，对双链 DNA 具有强烈的切割能力，这种切割能力需要两种小 RNA 介导-crRNA（CRISPR RNA）和 tracrRNA（trans-activating crRNA）。
tracrRNA 5' 端的序列和 crRNA 3' 端的保守序列通过碱基互补配对形成一个杂交分子，这个杂交分子通过其特殊的空间结构和 Cas9 相互结合形成一个蛋白-RNA 复合体，这个复合体通过 crRNA 5' 端特异性的 20 个碱基与目标 DNA 相结合，复合体中的 Cas9 通过其两个内切酶活性中心切断双链 DNA，其中 HNH 活性中心切断与 crRNA 互补的一条链，RuvC 活性中心切断非互补链。
材料与仪器
器材：一次性无菌手套、手术钳、注射器、PCR 仪、水浴锅、离心机、测序平台、培养箱
材料：小鼠、促性腺激素、麻醉剂、限制性内切酶、DNA 聚合酶、连接酶等、培养基
步骤
一、Cas9 靶位点的选择
1．Cas9 靶位点包含 20 个碱基，其中 5' 端应为 GG：紧邻靶点 3' 端的 3 个碱基构成 PAM 区，要求序列为 NGG（N 为任意碱基），可在正义链或反义链上选择靶位点。可参考如下的 Cas9 靶位点预测网站 http://zifit.partner.org/zifit/csquare9nuclease.aspx。
2．PCR 扩增靶点序列。从准备用于打靶的小鼠基因组中 PCR 扩增靶点及附近序列选择序列。在靶点周围设计引物，使其距离靶点两侧都大于 100 bp，并且 PCR 扩增产物最好不要超过 500 bp，且为单一条带。
3．测序确认靶点序列。将 PCR 产物直接送去测序（不需要 TA 克隆）。如果实测序列跟靶点的预测序列有出入，原则上应根据实测序列结果设计 gRNA 序列；但是，如果实测序列不再符合靶点选择的原则（例如，PAM 区不是 NGG，或 5' 端不是 GG），则应重新选择靶点；如果测序结果显示靶点序列杂合子，则最好重新选择实验材料。
4．选择实验材料。采用上述的 PCR 与测序策略筛选出足够量的靶点正确且为纯合的小鼠，后续针对该靶点的实验最好都用这一批小鼠进行。
二、构建 gRNA 体外转录载体
1．p-T7-gRNA 为 gRNA 的克隆与体外转录载体，载体骨架来自 pMD18-T simple（Amp 抗性），gRNA 序列的连入方向为 RV-M-＞T7-＞M12-47。
2．用 BbsI 酶切 pT7-gRNA，切胶回收，得到 gRNA 克隆骨架 pT7-gRNA＿BbsI，所得黏性末端如下所示：（骨架上 5' 各留下一个 4 bp 的 overhang，中间的小片段丢弃）：5'-TAATACGACTCACTATAGGaGTCTTCTAGAAGACgttttagag-3'，3'-·ATTATGCTGAGTGATATC CTCAGAAGATCTTCTGcaaaat cte-5'。
3．根据靶位点订购两条 oligo（均为 25 nt，s 序列与靶序列同向，As 反向）。以 PKHD1 基因为例：PKHD1 target oligo s： 5'-ataGGAAGATTGAGTGCACTACCgt-3'，PKHDI target oligo As：5'-taaaacGGTAGTGCACTCAATCTTC-3'。上排大写碱基序列为靶点序列，小写碱基序列为形成黏性末端所必需的固定序列，不能更改；下排大写碱基则需要根据靶点序列更改（注意 target oligo As 中大写的碱基为靶点的互补序列，只需要其中的 19 个碱基，最后一个 G 不需要合成）。
4．用 ddH2O 分别将 oligo 溶解为 10 μmol／L 的溶液，退火，得到黏性末端如下的小片段：PKHD1 target_an：5'-ataGGAAGATTGAGTGCACTACCgt-3'，3'-CTTCTAACTCACGTGTGGcaaaat-5'。
5．将退火后的片段与上述 gRNA 克隆骨架 pT7-gRNA BbsI 连接、转化，挑单克隆，用 RV-M 与 targetoligo As 作为引物进行菌液 PCR 鉴定（58 ℃ 退火，延伸 30 秒，30 cycle）。目的条带约为 130 bp。挑取阳性克隆测序，选取序列正确的克隆甘油保菌、提质粒。
三、制备 Cas9 mRNA 和 gRNA
1．制备 Cas9 mRNA
（1）制备 Cas9 mRNA 的体外转录模板：通过 XbaI 单酶切线性化 pSP6-2sNLS-spCas9 载体（Amp 抗性）（37 ℃，4 小时以上），取少量电泳确认线性化完全后，直接回收线性化产物。
（2）体外转录 Cas9 mRNA。
（3）添加 polyA 序列、回收可得到用于显微注射的 Cas9 mRNA（添加 polyA 序列可增强 mRNA 的稳定性和翻译效率）。
2．制备 gRNA
（1）制备 gRNA 的 PCR 体外转录模板：用 T7-er fwd 和 tracr rev 引物对，（mRNA 大小约为 2 000 bp）以构建好的 gRNA 体外转录载体为模板，使用高保真酶 PCR，得到 gRNA 体外转录模板（58 ℃ 退火，延伸 30 秒，40 cycle，40 μl 体系）。取 1 μl PCR 产物电泳，确认为单一条带（125 bp）后直接回收 PCR 产物，用于后续的步骤。T7-cr fwd 序列：5'-GAAATTAATACGACTCACTATA-3' Tracr rev 序列：5'-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3'。
（2）体外转录 gRNA
（3）回收 gRNA（Ambion 公司的 mirVana miRNA Isolation Kit）：1）用 RNase-free water 将 gRNA 转录体系稀释到 300 μl，加入 330 μl 的无水乙醇。2）将溶液加到回收柱中，10 000 g 离心 15 秒。3）加入 700 μl 的 miRNA Wash Solution I，离心 5~10 秒。4）加入 500 μl 的 wash solution II 的溶液，10 000 g，离心 5~10 秒，并重复一次。5）弃去收集管中的液体，10 000 g 离心 1 分钟，去除残余的液体。6）加入适量 95 ℃ 预热的 RNase-free water 或 Elution Solution，最大转速离心 20~30 秒，收集得到的 gRNA。
3．显微注射及首建鼠的鉴定
（1）Cas9 mRNA 和 gRNA 混合，通过显微注射到小鼠受精卵细胞质中，其过程和 TALEN 注射基本一致。
（2）高质量提取小鼠的基因组，用高保真酶扩增含有靶位点的 DNA 片段，进行测序，测序结果与野生型小鼠的序列对比。
来源：丁香实验
