如何在构建敲除细胞株时利用好CRISPR/Cas9技术？

从2013年1月份开始到现在，近2年的时间里，CRISPR/Cas9技术的应用领域被来自全球优秀的科学家们不断的扩大。其中包括基因敲除，定点突变，定点整合，基因沉默，基因定位和CHIP等多个领域，而且这个技术的应用领域还在不断的被扩大。

笔者基于多年的基因重组经验（系统的研究过ZFN / IOS / TALEN / CRISPR重组技术），以及采用CRISPR/Cas9技术构建超过50多个株系的经验，重点谈一谈构建敲除细胞株系时，如何利用好CRISPR/Cas9技术。

相比于其它重组技术，使用CRISPR/Cas9技术做基因敲除是效率最高，成本最低的技术。其中的关键因素无异于下面几点：

1) 明确需要敲除的基因序列
首先需要明确内含子和外显子序列；可以登录NCBI或者UCSC的网站可以方便的查到；

2) 合适的靶位点选择
一般建议设计2-3条，然后转染到细胞中，用Cruiser™ 和测序的方法验证哪个靶位点的活性最好；也可以登录经过体内活性验证的CRISPR/Cas9敲除载体库，根据自己所要研究的基因选择相关载体。如若没有，可以定制（可见本文章来源）；

3) 敲除载体选择
根据需要可以选择空载体，带抗性的载体（Puro/Neo），带荧光标记的载体（EGFP/RFP），双敲除载体等。其中空载体较小（8K），可以提高转染的效率；抗性便于后面进行抗性筛选，荧光标记的载体便于进行流式分选；

4) 单细胞生长
不同的细胞单个细胞的生长情况不一样。有的细胞长的快，有的细胞长的慢，有的单个细胞几乎就不长。这个就需要采取不同的方案了，这里推荐一个单细胞培养的小耗材：Cell Plaza™。设计精巧，采用的是共培养的原理，如果碰到不好长的单个细胞，可以试一试。同时，这个对于植物细胞做敲除时的小愈伤的生长很有帮助。从事植物基因敲除方向的研究人员，也可以试一试；

5) 阳性克隆筛选
关于这个部分可以参考之前发的一个专稿：《阳性克隆筛选方法汇总》

除了敲除外，CRISPR/Cas9还可以应用在定点突变，定点整合，基因沉默，基因定位等各个方向，每个方向都有不同的细节需要把握。这里就不一一阐述，如果需要了解更多其它信息，可以随时和我们联系。