CRISPR/Cas9 基因敲除实验全记录 -- 构建 sgRNA+Cas9 载体

前期记录

先确定目标基因

CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 确定目标基因

然后对目的基因进行背景调查

CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 目的基因背景调查

设计 sgRNA 及引物

CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- sgRNA 及引物设计

补充

上次推文我针对 sgRNA 设计方面增加了一部分内容，有一位特别棒的读者（简书名：chuxinxzz）在下方留言说可以使用 Cas9 +sgRNA 切割效率试剂盒验证切割效率，并且经实践得知，验证结果和实际编辑结果相差无几。感谢他给我的补充，这也是我写下去的动力，毕竟我一个人的精力是有限的，因此不论我好与坏，我都先把自己拎出来，以期待得到其他人的交流和答复，从而学到更多的经验。

昨天和今天

昨天我依照 golden gate assembly 的方法，参照了张峰老师实验室 protocol，使用了 BbsI 限制性内切酶和 T4 连接酶，将合成好的 sgRNA 插入到带有 Cas9 的质粒中；接着转化到感受态细胞中--复苏感受态细胞后--涂氨苄西林平板过夜培养--今天傍晚挑取单克隆菌落置于氨苄西林+LB 培养基中过夜培养，明日即可提取质粒并酶切验证。但由于 293FT 细胞冻存于液氮罐中，今日打台风没有来得及复苏该细胞，因此转染实验有拖后。

下一步

质粒小提试剂盒

酶切实验使用到的相关限制性内切酶（BbsI）

准备好 293FT 细胞（应提前准备，一旦酶切验证成功，立即转染筛选），也就是在这一步，可以使用上文提到的读者建议用的酶切效率试剂盒。如此看来，可以节约下至少 4 - 6 天的时间，当真是好办法的。

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