CRISPR-Cas9 基因敲除 sgRNA 设计

以最火热的 p53 为例

Step1 先找 p53 基因序列

1. NCBI--输入 p53 并选择物种 human：tumor protein p53 [Homo sapiens (human)]

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene

2. Ctrl+F，输入 sequence，快速定位（当然其实拉下去就是了），点击 Genebank

3. 下载 p53 基因序列

4. 用 SnapGene 软件打开序列，并简单了解每个元件

最好是可以学一下 SnapGene 这个软件的使用方法（有视频），个人认为，自行查资料理解每一个元件的含义和作用，可以帮助更快的补充背景知识。通过将散落的知识点集合起来，最后拼凑成自己的知识地图。

那么，为什么看起来好像这些 mRNA 都一样，怎么不只放一条完事了？不是滴。。。还有不一样的 mRNA。

在学生信的时候，听到过一个词，「可变剪接」，有了初步印象之后，在这里才算是实实在在看到了，我认真的数了数，mRNA 画了 15 条，TP53 蛋白也画了 15 条。那么我们可以理解为，TP53 有 15 个亚型，当然，每个亚型都有自己的 mRNA。

Step2 分析敲除位点（找到合适的敲除位置）

怎么样才能通过尽量少的 sgNRA 数量，去敲除尽量多的 TP53 蛋白。既然是做 knockout，那一定是要所有的亚型都不能表达。那么既然如此，就是要敲除掉这些亚型共有的区域，而且越前面越好（如果只敲除尾巴，TP53 合成了半个身子，半个身子的 TP53 说不定也能起作用），另外，也不能敲除掉内含子（说是，如果敲掉了，可能会形成进的剪接，就有新的蛋白出现）----知识点好伐～

1. 发现所有亚型共有区域

2. 查看详细信息，得知第一个 segment（片段）是从 12417 - 12498，一共 82 bp

3. 在 Sequence 中查看，复制一整个 segment 的碱基序列如下

segment 碱基序列

atggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatg

Step3 设计 sgRNA

首先，先附上鼎鼎大名的张峰实验室提供的网页

https://zlab.bio/guide-design-resources

1. 打开网页，选择网页工具--博德研究所

2. 粘贴序列，一步到位

3. 查看结果

我没有写结果怎么查看，或者分析结果耶，因为。。。因为做到这里，真正想学的人，感兴趣的人早就去看了。

4. 选择目的序列

略