CRISPR-Cas9 基因敲除 sgRNA 设计好之后

设计了 sgRNA 之后怎么办呢？还是这篇文章

先讲一下这里的框架

首先是实验设计

Experimental design

1. Target selection for sgRNA--选择靶点

详情见：CRISPR-Cas9 基因敲除 sgRNA 设计 https://www.jianshu.com/p/ 8222f449cb44

2. Approaches for sgRNA construction and delivery.

sgRNA 的合成和投递有两种方式：A）PCR；B）单独的 sgRNA 的表达质粒。

A）PCR 扩增的方法

U6：来源于人 U6 小核启动子，常用小 RNA 表达，转录本为 shRNA。

将 sgRNA 放到 U6 后面，利用 U6 的启动来扩增 sgRNA。

将这部分内容整合到 Cas9 expression plasmid pSpCas9（Cas9 表达质粒）中，一起共转。

B）sgRNA 表达质粒的方法

现在我要用这个方法来举例

设计 p53 引物

找到包括 sgRNA 序列的前后 1000 个碱基的序列（2000 bp）

找到的序列如下：

将上面复制的序列粘贴到 blast 中

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

系统反馈说我提交的序列和数据中的某基因很像，问我是不是就用下面这个。

选和不选我都试过了，选择的话，得到的引物有两对，如下（摘选了其中一个）：

如果不选的话

摘选一个引物：发现两种都可以得到比较好的引物，但是后者的引物有不少错配，前者的引物质量看起来更好（而且可以看到 primer 几乎是均匀的横跨 1 kb 大小，说明 map 到 target 上很好，后续验证 knockout 的时候也会好做）。

3. Design of repair template. 设计修复模板

这几个词不知道要看多少遍，我承认，我不止一次看到它，但是我每次都无法精确理解其中的含义

error-prone NHEJ pathway

都说修复方式有两种

（1）NHEJ：nonhomologous end joining，非同源末端结合，这个方式在没有修复模板的情况下发生的。

（2）HDR：homology-directed repair，同源直接修复。这个方式是在有修复模板的情况下。

修复模板：

（1）plasmid-based donor repair templates that contain homology arms flanking the site of alteration，也就是有一个供体质粒，质粒有两端同源序列（互补 DSB 用），两段同源序列之间就是我们要插入或者修改的内容。同源臂通常大于 500 bp

（2）single-stranded DNA oligonucleotides (ssODNs)，emm。。。就是需要两条单链寡核苷酸（ssODN），两臂也是带有同源序列（30～60 个碱基，但为了提高效率，最好是大于 40 个），在 Cas9 切开双链之后，模板的两臂同源序列直接互补（HDR，同源修复），从而完成了基因编辑。聪不聪明！

上传一张自己的理解图

4. Clonal isolation of cell lines 将已编辑的细胞分离开来

这个很好理解，在编辑片段中加入抗生素抗性基因或者荧光基因后，可通过抗生素筛选或者 FACS 分离。

5. Functional testing 功能验证

（1）SURVEYOR nuclease assay

（2）Detection of indels or HDR by sequencing.