TALEN 结合核移植技术进行基因敲除

对于可以通过细胞核移植技术实现动物克隆的动物，比如猪、牛、羊等，虽然采用直接显微注射 TALEN mRNA 的方式可行，但是由于受精卵数目有限，这种方法并不是非常高效。通过 TALEN 与细胞核移植技术结合，可以高效地对这些动物物种进行基因敲除，甚至基因敲入等操作。大致的流程是先通过 TALEN 技术在这些动物的成纤维细胞上实现基因突变，如基因敲除或基因敲入，再将这些完成基因操作的细胞的细胞核，通过核移植转移到去核的卵母细胞中，最后再移植到动物母体的子宫发育成动物子代。

器材：

①凝胶电泳仪

②水浴锅

③低温离心机

④培养箱、flask、100 mm 平皿

⑤PCR 仪

试剂：

①琼脂糖

②PBS

③培养基

④液氮

⑤细胞培养液（DMEM 高糖＋15％FBS）

TALEN 结合核移植技术进行基因敲除的主要操作步骤如下（以猪成纤维细胞为例）：

1．成纤维细胞的复苏与培养 从液氮罐中取出冻存的细胞，放入 37 ℃ 水浴锅中使其迅速融化，然后将冻存的细胞液吸出转移到 10 mL 细胞培养液（DMEM 高糖＋15％FBS）中混匀，1000 r／min，10 分钟，离心。

2．吸出上清培养液，在离心管中加入 15 mL 培养液重新悬浮细胞，将细胞悬液转入 75c㎡flask 中培养。我们一般选用低氧 5％O₂，5％CO₂ 培养，2 天换一次培养液。

3．在 2 天左右 flask 中细胞长到 75％ 时，即可进行转染。在转染 4 小时前更换培养液（DMEM 高糖+15%FBS+2ng/ml FGF)。

5．将消化的细胞悬液进行第一次细胞计数，离心，1000 r／min，10 分钟。去除上清，将细胞用 opti-MEM 洗一遍。

6．细胞悬液离心，1000 r／min，10 分钟。用 75％cytosalts 和 25％opti-MEM 重新悬浮细胞，此时细胞浓度应调整为 1x10／mL（假设在第一次细胞计数后约有 25％ 的细胞损失，所以加 75％cytosalts 和 25％opti-MEM 的量要有所调整）。

7．吸取 200 μl 细胞悬液，加入目的基因的 TALEN 质粒对和线性化的 neo 质粒（TALEN-L：TALEN-R：Neo 1：1：1，总共 10 μg DNA），混匀后加入 BTX 2 mm 电转杯，电转参数：250V，3 pulses／ms。我们用的是 BTX 电转仪，所使用的一些溶液和参数都参照了 BTX 的说明。没有转染的细胞离心后留在 flask 中继续培养。

8．将转染后的细胞悬液稀释后分别加入至 10 个 100 mm 平皿中培养，每个平皿中的起始细胞培养数为 3000 个。

9．在转染后 36 小时加入 G418 进行筛选，每 4 天换一次液。

10．G418 筛选 10 天左右，在 plate 中细胞单克隆长到 96 孔板的孔的大小时，挑选单克隆转入 24 孔板中培养：在显微镜下观察细胞克隆，在平皿底部划上画圈，吸出培养液，用 PBS 洗涤细胞，用 Apiezongrease 将克隆环（colony cylinder）固定在画圈的位置，在克隆环内加 2～3 滴 Trypsin，37 ℃ 消化 3 分钟，用含有血清的培养基终止消化，转移至 24 孔板内（可以离心去除 Trypsin 后再转移至 24 孔板，也可以第 2 天换液去除 Trypsin）。之后可以依次扩繁至 6 孔板、25c㎡flask。这期间可以收集一部分细胞进行基因型鉴定。

11．细胞株的基因型鉴定。采用 PCR 方法，在 TALEN 剪切基因组的切口 5＇上游和 3＇下游约 100 bp 距离设计一对引物。线性化的 Neo 质粒酶切位点附近约 200 bp 位置设计第 3 对引物（图 5-2-21）。带 Neo 的 DNA 片段无论是哪一方向插入到 TALEN 的切口，使用 3 对引物进行 PCR 都会产生 300bp 的带；而野生型 DNA 的 PCR 产物约为 200bp。这样通过 PCR 的片段大小判断细胞株的突变体是否有 Neo DNA 片段定点插入，插入的突变体是杂合子还是纯合子。

1. 基因型初步鉴定后，最后需要基因组 DNA PCR 测序确认 TALEN 位点定点插入 Neo 的 DNA 片段，或者野生型 PCR 产物是否同时发生移码突变。此外，插入的 Neo 表达框架可以通过 Cre／Floxp 重组系统去除。