求助｜red同源重组，打靶片段连接不上

我要敲除的基因bp为312，out全长为1012bp，打靶片段长度为1496bp，将pkd4的打靶片段电转进感受态以后，过夜培养（37℃），抗性平板上可见单菌落，挑取单菌落于kan+的培养基里过夜培养（37℃）也变浑浊，粗提DNA用欲敲除基因的out引物pcr扩增，电泳，结果跑出来的条带和阳性对照组一样（没有导入打靶片段的感受态），且条带为1000左右，我就怀疑打靶片段没链接上去，求大佬帮我看看究竟怎么回事。

打靶片段就是，欲敲除基因的前、后各50bp+酶切位点20bp，共70bp，为引物，提取的pkd4质粒为模板，高保真酶扩增后，胶回收得到的东西，胶回收浓度为118。

下图是我今天跑的验证，最后两条通道为阳性对照。maker是10000的，正常连接上，条带应该在2000上面。

因为我的菌在kan抗性板上生长了，但是又由于p出来的条带就是out全长的部分，所以我怀疑是不是pkd4打靶片段导了进去，但是没有连接上。求求大佬们帮帮孩子吧，真的走投无路了。