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求助|red同源重组,打靶片段连接不上

相关实验:TALEN 敲除基因

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dxy_h3mrv7jr

我要敲除的基因bp为312,out全长为1012bp,打靶片段长度为1496bp,将pkd4的打靶片段电转进感受态以后,过夜培养(37℃),抗性平板上可见单菌落,挑取单菌落于kan+的培养基里过夜培养(37℃)也变浑浊,粗提DNA用欲敲除基因的out引物pcr扩增,电泳,结果跑出来的条带和阳性对照组一样(没有导入打靶片段的感受态),且条带为1000左右,我就怀疑打靶片段没链接上去,求大佬帮我看看究竟怎么回事。

打靶片段就是,欲敲除基因的前、后各50bp+酶切位点20bp,共70bp,为引物,提取的pkd4质粒为模板,高保真酶扩增后,胶回收得到的东西,胶回收浓度为118。

下图是我今天跑的验证,最后两条通道为阳性对照。maker是10000的,正常连接上,条带应该在2000上面。

因为我的菌在kan抗性板上生长了,但是又由于p出来的条带就是out全长的部分,所以我怀疑是不是pkd4打靶片段导了进去,但是没有连接上。求求大佬们帮帮孩子吧,真的走投无路了。

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1 个回答

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Eason老歌迷

有帮助

可能有几个原因,red同源重组失败一般是因为DNA链断裂,还有可能是是同源臂太短(<13 bp)没有连接活性,连接不稳定,会断开。或者是同源臂不在载体末端,重组酶切不到可以连接的序列位置,连不了

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