【求助】4 kb片段连接pcDNA3.1+的问题

各位高手，兄弟最近忙于质粒构建，意图将一段长约4000 bp的片段，通过BamH1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下：
1. 通过LA Taq酶扩增，并纯化回收目的片段（引物中带有酶切位点，保护性碱基＝3，上游带有Kozak序列）；由于回收效率很高，所以在进行下一步双酶切时只加了12 μl的目的片段，H2O 20 μl，10 X K BUFFER 4 μl，两种酶各2 μl，37℃作用过夜（12-14 h），再进行胶回收。
2. 载体pcDNA3.1提取质粒后，也按照以上的体系进行双酶切，时间为6 h。
3. 将酶切后的木点片段和载体均取2 μl进行电泳，结果显示大小与预期相符，亮度相近。
4. 连接时，目的片段：载体=4--10：1（因亮度相近，所以按照体积比）都做过，10 μl体系和15 μl体系都尝试过。
5. 感受态为新制备的JM109，转化效率没有具体测过但别人用后均连接成功，阳性质粒眼观转化效率很高。
6. 限制性内切酶为TAKARA，T4连接酶是国内一家小公司的产品，不过实验室一直用，效果一直有保证，同期进行连接的其他同学也都连接成功。

结果：
转化后，平板上均有数量不等的菌落产生，少时4-5个，多时10来个。摇菌扩增8 h，进行菌液PCR检测（含阳性对照），检测组无阳性结果，但一直在1000 bp左右出现较弱条带，阳性组正常。提取质粒后，10 μl体系双酶切2 h，竟然在2000 bp和3000 bp处出现较弱条带（比Marker稍暗）。

特此悬赏10个叮当，请高手指点迷津。

如果有效果好的、适于长片段连接的方法，也请大家指教，多谢。

看了下你的情况，我有几个问题

1）为什么选用BamH1和EcoR1两个酶切位点？
从pcDNA3.1+载体图谱上看，这两个酶切位点相隔太近，你用双酶切载体制备vector的时候，如何确保两个位点的酶切充分完全？我的建议是，如果不想换酶切位点，线性化载体的时候就采用单酶切的方法，先切EcoRI，取少量产物跑胶确定已经线性化，再切BamHI，胶回收酶切产物。另外，如果时间和经济允许，目的片段序列也允许，建议换用HindIII+XhoI这两个酶切位点，NEB的这两个酶是可以双酶切的，我用这两个位点已经构建了几十个constructs了，屡试不爽。
2）是否有设置自连对照？
这个问题实际上是上一个问题的延续，本质上就是检测载体双酶切的效率如何，根据自连对照克隆生长情况，还可以大致推断整个连接系统是否有效，以及感受态的效率如何。不知道你有否设置自连对照。如果有，那么自连对照的克隆生长情况如何？有没有提质粒跑胶看看片段大小？
3）我从来不用PCR来鉴定克隆。这个也跟个人喜好有关吧，我总觉得这种方法太容易产生cross contamination。我比较喜欢用in gel screening这个方法，省事省时，而且很直观。

4）最后友情提示一下，凡是构建constructs的所有电泳和胶回收操作，一定要使用新鲜的TAE buffer,而且一定要用新鲜的双蒸水配制。

4kb的insert虽然有点大，但是难度还不是最大。
祝你成功！

要先确定你那么长的片段当中不含有这两个酶的酶切位点。但一直在1000 bp左右出现较弱条带，应该是非特异条带。还有就是酶切产物最好都进行电泳后回收，以免载体切下的片段又连回载体上，降低了成功率。如果实在不行的话，考虑ＴＡ克隆。

BamHI、EcoRI可以的，我做过。
载体和片段都是胶回收的？在回收片段纯度没有问题下考虑以下因素1、 克隆长得少可能表示载体酶切尚可，很可能片段酶切得不好。合成的引物是否完整？上面的酶切位点是否正确？如果时间允许，克隆到T载体上再酶切。很多PCR产物酶切连接不上的问题克隆到载体上后再酶切都没有问题了。
2、片段测过序吗？内部是否有这两个酶？

tozitong1983，感谢您的回答，很专业。
1. bamh1和ecor1这两个酶是我个人比较偏爱的酶。我构建过十多个重组质粒，几乎都是用这两种酶，一直也没出现过问题（pet30a载体上这两个酶是紧挨着的，重组质粒构建的也很顺利。）我查了载体谱图，hind3我用不了，而且bamh1和ecor1离的不算近，差了10多个bp。实验室一直用takara的酶，没有neb那么好，呵呵。
2. 自连对照已经补充了，结果还没有出。

tochenjy1974和dorianmell站友，目的片段中不含有这两种酶切位点序列。
已经开始进行ta克隆

如楼上战友所述，TA克隆的确是长片段亚克隆的好的手段。我最初开始学习构建质粒的时候也是先上TA，不过我们实验室一直使用一种KAPA HIFI readymix的酶，效果很好，保真性也非常非常高，就是做TA的时候比较麻烦，需要把PCR产物纯化回收后再加一次A tail，而就是这一步我感觉一直没有摸索到最优化稳定的条件，所以每次加A后连pCR2.1
转化的结果都不稳定，有时候长的多有时候长得少，之前曾经就这个问题发帖向大家请教过，有战友反应这一步其实很简单，没什么很难得因素。但是不管怎样，我现在对长片段的TA克隆是有心理阴影了，所以我一般都是直接设计带酶切位点的PCR引物，扩增出目的片段后直接酶切再连目的载体，至今还没有做不出来的。

再次祝你好运，有进展记得与大家分享。

4KB的PCR产物片段直接双酶切克隆，要靠运气了。强烈建议TA克隆，测序OK后，再换载体，这样的话成功率才会高。
楼主需要确认几点：
1，PCR产物两端的酶切位点在不在；
2，筛选阳性克隆时，不管是菌落PCR还是质粒酶切，由于片段与太大，都不好去判断。建议：如果是PCR鉴定，则可以在中间设计一条引物，与目的载体的一条通用引物进行配对，扩增出来的大小为1k左右，这样便于判断。如果采取酶切方法鉴定，建议在片段中选取内切酶，只要切出来的大小符合我们理论上的要求即可；
3，克隆时阴性对照非常重要。
希望对你有帮助

todolphin_705_200再次感谢你的回答。
载体对照组的转化结果，只长了一个菌落，应该还可以吧

tozitong1983，KAPA HIFI酶一定很贵吧，呵呵
载体对照组的转化结果，只长了一个菌落

好像100此反应需要700多块钱，虽然贵点，不过真的很省事省时间。呵呵，非广告。

自连对照组只有一个菌落，我觉得不是太好，可能你的感受态效率不是太高。一般双酶切的载体，自连对照应该有十来个甚至几十个菌落出现，不过要比加了insert的那一碟少得多。所以我觉得你有必要再检查下你的感受态是否有问题。

当然，连接体系的效率偏低也可能出现这样的情况。

tozitong1983，我做得载体对照如下
H2O 7ul+切好的载体 1ul+10X buffer 1ul+T4连接酶 1ul。

如果对照长得菌落多，说明载体切的不彻底，不适合连接。对吧?

[来自丁香园WAP]
最新进展，终于将4kb片段连到宝生物t载体了，也双酶切回收了目的片段进行连接。转化长了8个菌落，扩增后碱法小提质粒，双切结果却是在2000多和1000那有两条带，很奇怪啊

tozitong1983最新进展，终于将4kb片段连到宝生物t载体了，也双酶切回收了目的片段进行连接。转化长了8个菌落，扩增后碱法小提质粒，双切结果却是在2000多和1000那有两条带，很奇怪啊

先确认T载体上的连接是成功的（酶切鉴定+4KB全长测序验证）。

如果这一步没问题，那么恭喜你，终于迈出成功的一步。

你的第二步，看起来有些问题，8个克隆效率明显偏低。小提质粒后双酶切size也不对，即使自连的情况下size也不对。建议，
1）检查你的酶是否有问题？可以找一个已知的含有这两个酶切位点的质粒过夜酶切再跑胶看看size是否正确，酶切是否完整。
2）请再次确认你的感受态效率ok，没有污染。
3）重新酶切制备insert和vector，然后连接转化。整个过程注意我上面提到的那些细节。

如果还是做不出来，一个简单的建议，换实验室别的人来做吧，或许换个人试试很快就搞定。你也正好可以比较下自己的问题出在哪里

祝你好运。

不成熟的看法：如果一切都正常，包括载体，可能是PCR产物有问题。PCR鉴定用的引物是目的片段扩增用的引物吗？

to coffeeshine,是的

tozitong1983我先用的片段是从T/A克隆的质粒上切下来的，载体是从另外一个阳性质粒上切下来的

T载体上的正确吗？最好是测序验证一下。
我初步判断你从T载体上切下来的片段就有问题，所以你再与其它载体连接后长出的克隆酶切就有问题。大片段的酶切很容易混淆。
TAKARA的T载体大小有3K左右，你4K的片段和3K的片段比较难分开。如果T载体质粒测序OK的话，你需要将片段切下来这一步做准确了。建议你用合适浓度的琼脂糖胶分离，约1.5%左右，跑胶时间可能在2小时以上。

你连接了多久啊

你好，这个重组质粒构建了将近一个月，最后成功了。期间一直用TOP10高效率感受态，但是检测结果一直出现莫名其妙的问题，考虑可能是质粒与宿主菌之间有一些奇妙的关系。后来换成高效率的JM109感受态，一次就连接成功。

我也要做分子克隆方面的，不懂的地方还希望得到你的指教

好的，大家互相交流

我上次将连接产物拿过去测序了，结果发现有一个碱基发生了突变。会是什么原因呢？

在PCR过程中，发生碱基突变是常事。任何一种高保真酶都不可能完全保证不发生突变；越好的酶，发生突变的几率越低。

仅仅发生一个突变还好，如果突变之后，氨基酸没变，就继续用吧。
如果你想矫正一下，可以看一下一下突变的位置。如果就在目的片段的5`端或3`端，可以通过设计引物的方式矫正；如果在序列内部，可以通过SOE PCR或者买一些定点突变的试剂盒。

同学你好,这个帖子都好久了,不过我菜鸟一个刚开始做,也是连接4000+的片段,我想连到pcDNA3.1上,两个多月也没成功,到T载体也连不上去,不知道您有什么意见!

同学你好，大片段的连接确实比较麻烦，经过我几年的经验，以下几点是key point：
1. 感受态种类与效率，尤其转化效率，一定要很高。效率越高转化成攻率越高。有的时候片段与载体已经连接成功了，只不过在转化时，自身空间结构较大，没有转进去。
2. 酶切反应：如果可以，请用thermo fisher的内切酶，无论单酶切还是双酶切，6 h足够了。takara的酶批次间稳定性经常有问题，而且长时间酶切，片段很容易切碎。
3. 4000+的片段先加A连接到T载体上，利用片段两端的酶切位点双切，回收后再连接载体。
4. 如果第3步还是不行，请尝试一下这个偏方：找一个新载体p，长度要比pcDNA3.1还要长，先练到载体p上，切下来再连接pcDNA3.1。。。。。。。这个方法，不是常规protocol，我当初遇到一些问题时，出此下策，竟然成功。

预祝实验顺利！