【求助】再问几个NF－kB的问题

1、再做NF-kB的时候不少文章用阳性对照大部分用TNF或LPS，有些不用。弱弱问下，为什么要设立阳性对照？怎么样合理去设立阳性对照？我做的实验怀疑疾病可能与内毒素有关，是否只是设一个LPS的阳性对照就好了，还是不设也可以？
2、TransAMTM 是否可以完全代替EMSA？还是他们两个是互补?我看到大部分文献还是用EMSA多。
3、这个问题，不好意思，我还在查文献，就是怎么样可以查出和确定NF-kB哪个结构域起了作用？我很想知道这个问题。
4、没有P50，P65单独可以入核，结合DNA表达吗？

感谢lwjssry在短信中的答复，谢谢！

感谢lwjssry在短信中的答复，谢谢！

不好意思，刚看到你的pm，可能我的回答晚了，那就供大家交流探讨吧！：）
1、阳性对照除了实验自身设计需要之外，其一个重要作用就是给出条件对比作为结果参照，也就是你成像条件下阳性的条带是什么样。在对照组强阳性的情况下，是可以没有阳性对照的。另外，阳性对照还可用来调整实验条件，如果即定阳性对照都没做出来，那么说明你的EMSA实验步骤或试剂有问题。一般设一个阳性对照即可，有时还需要阴性对照。如果你找公司做，他们直接会提供阳/阴性对照供选择，但价钱较贵。
2、看过一些文章，通常是用transAM这种ELISA的定量方法来进一步证实EMSA半定量的结果，个人认为EMSA比较直观，相对不易造假，其经典地位是不容动摇的。
以下的帖子可以参考一下：
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4320752_1.html
http://www.takara.com.cn/activeproducts/am_2_04.htm
3、提高检索能力，多读文献吧，你的问题含糊，答案只能如此了。
4、NF-κB由两类亚基形成同源或异源二聚体。一类亚基包括p65(也称RelA)、RelB和C-Rel；另一类亚基包括p50和p52。最常见的NF-κB亚基组成形式为p65/p50或p65/p65。NF-κB未被激活时和IκB-α形成一个复合物，分布在细胞浆中。在炎症因子等可以激活NF-κB的刺激存在的情况下，IκB-α会在Ser32和Ser36被磷酸化，随后被泛素-蛋白酶体途径降解。NF-κB和IκB-α解聚后，其核定位序列被暴露，从而被转运到细胞核内促进NF-κB依赖的基因转录。NF-κB是同源或异源二聚体。一个亚基单独入核的理解是不对的。

再此也感谢下doctormy

我知道NF－kB一般是二聚体入核
主要我是想自己做p65，然后在导入细胞，在考虑P65怎么样才能入核的事情?
第3个问题，我主要是想知道，就LPS刺激细胞后，我怎么样才能确定在此情况下P65蛋白的哪个结构域激活了？怎么样去测定这个结构域？

最近做了好多次NF-KB的EMSA，上传一张，恳请大侠们帮忙。我用的探针是上海生工合成的，
图中：1道：pierce公司提供的EBNA组
2道：大鼠肾核蛋白＋标记探针组
3道：大鼠肾核蛋白＋标记探针＋200倍未标记探针。
想请教为何第3道的特异竞争反应中还会有迁移带啊？
做了3次几乎都一样，快崩溃了!