受精卵显微注射 TALEN mRNA 敲除基因

对于小的模式动物，如小鼠、大鼠、斑马鱼，由于采集受精卵数目多，可以采用显微注射 TALEN mRNA 方法到动物的受精卵中实现全身基因敲除。对于猴子、树驹等不可大规模获取卵巢、采集卵母细胞的非经济动物，也可采用显微注射 TALEN mRNA 方法敲除基因。大致步骤为先以 TALEN 质粒为模板，体外转录出 mRNA，再显微注射 TALEN mRNA 到受精卵中。

器材：

①凝胶电泳仪

②水浴锅

③低温离心机

④培养箱、注射器、无菌手术器械

⑤PCR 仪

试剂：

①培养基

②卡那霉素；氯霉素；潮霉素

③限制性内切酶、DNA 连接酶

④琼脂糖凝胶

⑤hCG

受精卵显微注射 TALEN mRNA 敲除基因的主要操作步骤如下：

1．体外转录 TALEN mRNA

（1）线性化 TALEN 质粒：pCS2-TALEN 载体 polyA 后有 NotI 位点，使用 Not I 酶切 TALEN 质粒，线性化 pCS2-TALEN 载体，然后使用 DNA 纯化柱子（Qiagene，QIAquick PCR Purification Kit，Cat NO．28104）回 收 DNA。

（2）转录 TALEN mRNA：采用体外转录 mRNA 试剂盒进行体外转录 TALEN mRNA ［mMESSAGEmMACHINE® SP6 Kit，Invitrogen（Ambion）］ 或 ［mMESSAGE mMACHINE® T7 Kit，Invitrogen（Ambion）］。转 录详细操作可参见试剂盒说明书。

1）按配方加样，构建体外转录反应体系。37 ℃ 反应 2 小时。反应完成后，可以取 2 μl 跑凝胶电泳检测体外转录 mRNA 的效果，跑胶所用凝胶需要用 RNase-free 试剂配制。

2）反应结束后，使用 LiCI 沉淀回收 TALEN mRNA：在上述反应中加入 15 μl DEPC H₂O 和 15 μl 2.5 mol／L LiCl，-20 ℃ 沉淀 30 分钟。4 ℃ 最大转速离心 15 分钟，弃上清；加入 1 mL 70％ 乙醇，4 ℃ 最大转速离心 10 分钟；弃上清，注意管底的白色沉淀，最后溶于 20～30 μl DEPC H₂O 中，nanodrop 定量。测浓度一般都在 200～500 ng／μl。

3）将左、右两边的 TALEN mRNA 混合，按照推荐的 mRNA 浓度显微注射到动物的受精卵中，初次实验时可按照推荐浓度，做不同浓度梯度进行实验。

2．显微注射 TALEN mRNA 到动物受精卵

（1）受精卵收集和培养：注射 hCG 进行超排，注射 17～19 小时后，脱颈处死受孕的小鼠，取出输卵管，移到含有透明质酸酶的 M2 操作液中。反复吹打出受精卵，将受精卵吸到 M16 培养液中，在 37 ℃ 培养箱内培养（具体的操作见相关章节）。

（2）显微注射：选取发育形态正常的受精卵进行显微注射。胚胎收集 4～6 小时后，注射针吸取 TALENmRNA 开始进行显微注射。注射针进入细胞质开始进行注射，直至细胞略微膨胀为止。注射过的受精卵，须迅速移到 M16 培养液中，并在 37 ℃ 培养箱内放置培养。受精卵分批进行注射，每批注射胚胎的量，根据实验员熟练程度而灵活掌握，需注射一共 100 个以上的受精卵。

（3）胚胎移植：注射后存活的受精卵，在显微操作的第 2 天移植到交配后 12 小时假孕雌鼠的输卵管中。移植可单侧移植，也可双侧移植。每侧移植胚胎 15～20 枚（具体的操作见相关章节）。

1.RNA 非常不稳定，极容易被 RNase 降解，下面体外转录 TALEN mRNA 实验步骤请使用 RNase-free 的枪头、Tube。配制溶液请使用 DEPC 处理过的水。