受精卵雄性原核显微注射法构建Cre转基因动物
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受精卵雄性原核显微注射法构建 Cre 转基因动物
Cre转基因动物即时空特异性表达重组酶Cre的转基因动物。构建此动物的目的在于为loxP转基因动物提供重组酶Cre。
由于在该转基因动物中Cre的表达被置于特异性启动子的调控之下，因此它会以组织细胞特异性和发育阶段特异性的方式向loxP转基因动物提供Cre重组酶，以便在特定的发育阶段、特定的组织细胞中使两个loxP之间的区域缺失。
当然，实现此目标的最后方法就是让这两种转基因动物进行杂交。
构建Cre转基因动物与构建普通转基因动物的方法相似，最为常用的基因转移方法仍为受精卵雄性原核显微注射法和胚胎干细胞的囊胚注射法。
先将Cre时空特异表达载体线性化后注入雄性原核，使其以随机插入的方式整合进基因组，然后将该受精卵或早期胚胎植人到假孕母鼠的输卵管或子宫内。受精卵雄性原核显微注射法的具体步骤简述如下
1．准备假孕母鼠
将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。
受精卵雄性原核显微注射法构建Cre转基因小鼠示意图
2．受精卵的准备
可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素(HCG)，以促使其超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。
3．基因导入
用显微注射装置将目的基因溶液导人受精卵雄性原核内。
4．胚胎移植
将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟。
5．对幼鼠的鉴定
(1)幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合。
(2)建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50％概率带有整合的基因供实验用。也可将合适的组织进行细胞培养，建立细胞系。
(3)自小鼠内脏提取RNA，与目的基因探针做分子杂交，以鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验(ELISA)或放射免疫测定(RIA)等。亦可取胚胎进行分析。
