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loxP转基因动物的构建

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loxP 转基因动物的构建
 
    loxP转基因 动物是在基因组中待修饰基因区域的两侧各插入了1个loxP位点的转基因动物。该转基因动物的构建首先需要一种特殊的载体,这种载体主要由3个部分组成:①分别存在于打靶载体5,和3’臂端,是与靶基因一定区域相同的同源序列,其作用是介导打靶载体与靶基因之间的同源重组。②位于5’和3’臂端之间有待敲除的靶基因区段序列或有待敲人的外源序列和选择标志基因。选择标志基因一般为neo―2A基因,含有两个选择标志:一个为G418抗性基因(neo),为细胞提供针对G418的抗性,为正筛选标记;另一个为胸腺嘧啶激酶基因(tk),可以把培养基中的更昔洛韦(ganciclovir)磷酸化为对细胞有毒的化合物,为细胞提供负筛选标记。③3个loxP位点,分别位于待敲除靶基因同源序列的两侧和选择标志基因的两侧。
 
    一般采用线性化的打靶载体来转染胚胎干细胞,常选用位于同源序列边缘或之外的限制性内切酶作用位点作为打靶载体线性化的切点。取代型打靶载体整合进基因组的结果是靶载体中的序列置换掉基因组中的同源序列。
 
    loxP转基因动物的构建一般采用胚胎干细胞基因转移法。在这个过程中,首先要构建具有3个loxP位点的打靶载体。该载体中loxP位点的分布情况如下:选择标志基因(如72eo―2A)的两侧各一个,从而能够使选择标志基因在Cre的介导下消失,以避免它们在基因组中的存在可能给转基因动物造成危害;预期要进行敲除的基因两侧各一个,在Cre的作用下可以介导目标基因的敲除。在载体构建成功后,用电穿孔等方法将其导人到胚胎干细胞中,使其以同源重组的方式整合进干细胞的基因组,之后经G418筛选,用PCR和DNA印迹(Southernblotting)等方法来确定靶基因是否发生了同源重组。最后,为了去除筛选标志基因,要向上述的胚胎干细胞中导人Cre的瞬时表达质粒。这时,在Cre的作用下,具有3个loxP位点的靶基因区域会产生3种后果:①发生工型缺失,3个loxP之间的所有基因(靶基因和选择标志基因)全部被切除,只保留1个loxP位点。②发生Ⅱ型缺失,只有选择标志基因被切除,两个loxP位点及其之间的靶基因被保留。发生了工或Ⅱ型缺失的胚胎干细胞在更昔洛韦选择培养下均能生长,再用PCR和DNA印迹等方法来对缺失突变的结果进行鉴定。③Ⅲ型缺失,靶基因被切除而选择标志基因被保留,发生此型突变的细胞在更昔洛韦存在时无法生存。经过更昔洛韦培养基筛选后,可以筛选出发生Ⅱ型缺失的胚胎干细胞。再用囊胚注射法将经过这种遗传改造的胚胎干细胞注入囊胚,最后移植入代孕母鼠的子宫内,获得具有Ⅱ型缺失突变的转基因动物,在其基因组中特定的基因位置具有两个loxP位点。
 
loxP载体与基因组发生同源重组过程示意图
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