胚胎干细胞的囊胚注射法构建Cre转基因动物

胚胎干细胞的囊胚注射法构建 Cre 转基因动物

先将Cre时空特异表达载体 线性化，之后用电穿孔等方法将其导人胚胎干细胞中，并以同源重组的方式整合进胚胎干细胞的基因组。这种经过遗传改造的胚胎干细胞再被注入囊胚，最后将胚胎植入假孕母鼠的子宫，使其发育成为一个个体。囊胚注射法的具体步骤如下。

(1)选择合适的载体，将Cre重组酶的编码基因与其重组，构建重组质粒。

(2)重组质粒线性化后，用电穿孔、脂质体等方法将其转人体外培养的小鼠胚胎干细胞中。

(3)体外筛选稳定整合外源基因的胚胎干细胞。

(4)筛选出的胚胎干细胞被重新注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育为一个完整的胚胎。

(5)产出的嵌合体小鼠通过杂交，最终获得稳定整合Cre重组酶的纯合体转基因小鼠。

采用雄性原核显微注射法时，Cre表达基因是随机的整合到基因组中去的，因此其表达的时空特异性和表达水平除了受启动子的影响外，还会受到整合位点的影响，因此需要同时生产多个转基因鼠家系，以便从中选出符合要求的转基因鼠。采用这种方法时选择合适的启动子就显得尤为重要。该方法的优点是操作过程比较省时省力。

另外一种构建Cre转基因小鼠的方法是采用同源重组，使Cre基因置于内源性启动子的控制之下。这个策略可以实现Cre基因表达的最佳化，因为这时所有的基因表达调控元件均处于天然位置，可以避免常规转基因小鼠通常出现的异位表达问题。此外，采用这种方法只要获得靶基因的同源序列就可以进行，没有必要再去详细研究其启动子。但是该方法的缺点是操作过程费时费力。因此，当有合适的启动子可供选择时，多数研究者宁愿使用雄性原核显微注射法生产Cre转基因小鼠。

由此我们知道，Cre转基因动物的关键在于控制Cre基因表达启动子的选择，因为启动子活性的时空特异性决定了Cre基因表达的时空特异性，进而决定Cre介导的loxP转基因动物基因组中相应靶基因发生预期突变的时空特异性。可以理解，借助于Cre／loxP系统的作用，利用一种Cre转基因动物就可分别对多种基因在个体发育或疾病发生中的作用机制进行研究。理论上，Cre／loxP系统介导的条件性基因敲除具有对任何发育阶段的任何组织细胞中的任何基因进行功能研究的潜力。