搞定 CRISPR/Cas9 系统操作
生物学霸
CRISPR/Cas9 是一种强大的基因组编辑工具，今天我们介绍 CRISPR/Cas9 系统操作。以下操作说明是基于作者冰糖个人实验室操作，仅供参考。
质粒介绍
我们使用的是 Feng Zhang 实验室的系统的 pX330 质粒，如下图所示：
酶切系统
37 ℃, 3 hr；Run 1% gel，回收。Elute 到 50 mL H2O。我们利用 BbsI 消化载体形成粘末端，以利于下游 oligo 退火产物的连接；酶切时请充分，且绝对不能加 CIP 处理。
Target 设计：通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到 NGG（N 代表任意核苷酸），然后找到其紧邻的上游 20 nt 即可（如上图）。
目的位置的选择：我们绝大部分时候的目的是完全 KO 一个基因，其原理是利用移码突变（CRISPR/Cas 系统诱导产生 indel）。所以我们一般选择距离起始密码子 ATG 下游 200bp 范围内的 exon 区域。另外，通常一个基因往往会转录成 2 个以上的 isoforms，所以请选择尽量靠近 5』端的公共部分，保证每个 isoform 都会成功移码突变
通常情况下，为了便于下游 KO mutants 的鉴定，我们往往可以作如上设计：即 Cas9 的切割位点刚好被一个酶切位点跨过，且附近至少 100 bp 内酶切位点唯一。
为了减少 Off-Target 效应，请把设计好的 Target 放在括号中的网址里去做预测，尽量找到一条脱靶效应较小的来继续下游实验。
20 nt 确定之后，请按照如上图所示合成两条配对的普通 oligo 即可。请注意突出的粘性末端以及补加的一个转录起始位点 G。
Validate target 的编辑效率
单克隆的挑取
单克隆可以有限稀释到 96-well plate（～30 cells/plate）（CHO、293T、HeLa、MEF 等细胞系推荐使用）。如果编辑效率 50%，推荐分两块 plate 即可，最终拿到 20-30 个单克隆一般可以得到成功 KO 的细胞系；或者铺到 100 mm dish 里，一周后挑取单克隆（这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系如 SV589 等，但是挑取的单克隆往往不纯，有时需要重新亚克隆）。
根据设计，推荐使用酶切鉴定的方法（见设计部分），通量高；如果抗体比较好用，推荐使用 WB 检测蛋白，这种方法最彻底；最末一种方法就是直接测序鉴定，该种方法费时费力费钱，建议设计时尽量避开。
PS: Feng Zhang lab 后来推出 lentivirus 版本的 Cas9 质粒系统 (lentiCRISPR v2)。这个系统设计起来和 pX330 一样，但克隆构建使用的酶切位点不同。
