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搞定 CRISPR/Cas9 系统操作

生物学霸

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CRISPR/Cas9 是一种强大的基因组编辑工具,今天我们介绍 CRISPR/Cas9 系统操作。以下操作说明是基于作者冰糖个人实验室操作,仅供参考。

质粒介绍

我们使用的是 Feng Zhang 实验室的系统的 pX330 质粒,如下图所示:



酶切系统


37 ℃, 3 hr;Run 1% gel,回收。Elute 到 50 mL H2O。我们利用 BbsI 消化载体形成粘末端,以利于下游 oligo 退火产物的连接;酶切时请充分,且绝对不能加 CIP 处理。

Target 设计

Target 设计:通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到 NGG(N 代表任意核苷酸),然后找到其紧邻的上游 20 nt 即可(如上图)。

目的位置的选择:我们绝大部分时候的目的是完全 KO 一个基因,其原理是利用移码突变(CRISPR/Cas 系统诱导产生 indel)。所以我们一般选择距离起始密码子 ATG 下游 200bp 范围内的 exon 区域。另外,通常一个基因往往会转录成 2 个以上的 isoforms,所以请选择尽量靠近 5』端的公共部分,保证每个 isoform 都会成功移码突变


通常情况下,为了便于下游 KO mutants 的鉴定,我们往往可以作如上设计:即 Cas9 的切割位点刚好被一个酶切位点跨过,且附近至少 100 bp 内酶切位点唯一。

为了减少 Off-Target 效应,请把设计好的 Target 放在括号中的网址里去做预测,尽量找到一条脱靶效应较小的来继续下游实验。



20 nt 确定之后,请按照如上图所示合成两条配对的普通 oligo 即可。请注意突出的粘性末端以及补加的一个转录起始位点 G。

克隆构建


Validate target 的编辑效率


单克隆的挑取

单克隆可以有限稀释到 96-well plate(~30 cells/plate)(CHO、293T、HeLa、MEF 等细胞系推荐使用)。如果编辑效率 50%,推荐分两块 plate 即可,最终拿到 20-30 个单克隆一般可以得到成功 KO 的细胞系;或者铺到 100 mm dish 里,一周后挑取单克隆(这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系如 SV589 等,但是挑取的单克隆往往不纯,有时需要重新亚克隆)。

单克隆的鉴定

根据设计,推荐使用酶切鉴定的方法(见设计部分),通量高;如果抗体比较好用,推荐使用 WB 检测蛋白,这种方法最彻底;最末一种方法就是直接测序鉴定,该种方法费时费力费钱,建议设计时尽量避开。

PS: Feng Zhang lab 后来推出 lentivirus 版本的 Cas9 质粒系统 (lentiCRISPR v2)。这个系统设计起来和 pX330 一样,但克隆构建使用的酶切位点不同。

文章来源:文章由冰糖授权转载
图片来源:网络

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