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TALEN 的活性检测

实验分类:

实验动物

最新修订时间:

简介

TALEN 质粒构建好后,在进行动物或细胞操作前,最好检测其活性,确保 TALEN 的有效性,及减少后续筛选突变体的工作量,TALEN 活性越高,后续的筛选突变体的工作量越少。常用的检测 TALEN 活性的方法有以下 3 种:luciferase SSA 法、非配对内切酶法-T7E1 法和限制性内切酶法。

原理

luciferase SSA 重组检测 TALEN 活性原理:一个终止子在 luciferase 的编码区中央(红色标记),luciferase 没有活性。为检测 TALEN 剪切活性,将一个 TALEN 的靶点位置序列插在终止子后(蓝色标记)。在 TALEN 的作用下,靶点位置产生 DSB,细胞通过同源重组方式修复 DNA,形成一个有活性的 luciferase。通过与参照的比值变化反映 TALEN 剪切的活性水平。
非配对内切酶法-T7E1 法的技术原理:如果通过 TALEN 发生突变,将基因组 DNA 做 PCR,并与野生型 DNA 的 PCR 产物等量混合,并退火杂交,将产生非配对 DNA 片段,将能被非配对内切酶-T7E1 剪切。若没有发生突变,将产生配对完整 DNA 双链,而无法被非配对内切酶-T7E1(或 surveyor)识别剪切。这种方法没有限制,基本上在转染效率高的细胞系就可以进行检测。
限制性内切酶法的技术原理:在 TALEN 靶点位置中间序列 Spacer 中有限制性内切酶切位点,如 Hind III。如果通过 TALEN 发生了突变,这个位点将可能被破坏,而不能被 Hind III 酶切;同时野生型的细胞不受影响,仍可被 Hind III 酶切。

来源:丁香实验团队

操作方法

luciferase SSA 法检测 TALEN 活性

TALEN 质粒构建好后,在进行动物或细胞操作前,最好检测其活性,确保 TALEN 的有效性,及减少后续筛选突变体的工作量,TALEN 活性越高,后续的筛选突变体的工作量越少。常用的检测 TALEN 活性的方法有以下 3 种:luciferase SSA 法、非配对内切酶法-T7E1 法和限制性内切酶法。

非配对内切酶法-T7E1 法检测 TALEN 活性

TALEN 质粒构建好后,在进行动物或细胞操作前,最好检测其活性,确保 TALEN 的有效性,及减少后续筛选突变体的工作量,TALEN 活性越高,后续的筛选突变体的工作量越少。常用的检测 TALEN 活性的方法有以下 3 种:luciferase SSA 法、非配对内切酶法-T7E1 法和限制性内切酶法。

限制性内切酶法检测 TALEN 活性

TALEN 质粒构建好后,在进行动物或细胞操作前,最好检测其活性,确保 TALEN 的有效性,及减少后续筛选突变体的工作量,TALEN 活性越高,后续的筛选突变体的工作量越少。常用的检测 TALEN 活性的方法有以下 3 种:luciferase SSA 法、非配对内切酶法-T7E1 法和限制性内切酶法。

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