细胞因子活性检测

检测细胞因子对阐明机体免疫应答及其调节机制、免疫相关疾病的发生、发展规律和知道临床治疗均具有重要意义。细胞因子的检测主要分为免疫学、生物学和分子生物学三种检测方法。免疫学方法主要采用双位点ELISA法定量检测细胞因子，分子生物学方法主要检测细胞因子mRNA表达水平。本部分只介绍生物学方法检测细胞因子活性，其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株（即靶细胞）的促增殖作用，以增殖细胞中的DNA合成或酶活性为指标，间接推算出细胞因子的生物学活性单位。

一、IL-1生物学活性检测
白细胞介素-1（IL-1）主要是由活化的单核-巨噬细胞合成和分泌的一种细胞因子，具有活化淋巴细胞、协同刺激胸腺细胞增殖、参与抗体产生和促炎症反应等多种生物学功能。IL-1有IL-1α和IL-1β构成，结合同种受体，表现相同的生物学活性。用于检测IL-1生物活性的方法有多种，如小鼠胸腺细胞增殖法、D10G4.1细胞增殖法、EL-4细胞测定法等。

小鼠胸腺细胞增殖法
IL-1与小鼠胸腺细胞共同培养时，IL-1可刺激小鼠胸腺细胞增殖。进一步通过3H-TdR掺入法或染料摄入法判定小鼠胸腺细胞增殖量，推定IL-1的生物学活性。通过检测IL-1的生物学活性，可了解单核-巨噬细胞等的功能。

试剂与材料
（1）10%FCS-RPMI-1640培养液。
（2）LPS 用10% FCS-RPMI-1640配制10ug/ml。
（3）刀豆蛋白A（ConA） 用10% FCS-RPMI-1640配制2.5ug/ml。
（4）3H-TdR
（5）C57BL小鼠，6~10周龄，雌雄均可。

操作流程
（1）小鼠巨噬细胞产生IL-1的诱导
①常规收集小鼠腹腔巨噬细胞，10%FCS-IMDM培养液悬浮细胞2×106/ml，接种于24孔培养板，0.5ml/well。
每孔加20ug/ml LPS0.15ml，37度，5%CO2孵育36~48小时。
③此时培养上清内含巨噬细胞分泌的高水平IL-1，收集培养上清，12000r/min离心15分钟，将上清移入新的1.5ml试管中，-20度冻存。
（2）IL-1的生物学活性测定
①胸腺细胞的制备：颈椎脱位处死小鼠，无菌取胸腺至于平皿中，加入5ml10%FCS-IMDM培养液，200目不锈钢网制成单个细胞悬液；1500r/min离心10分钟，再用5%Hank’s液洗涤细胞2次后，重悬于10%FCS-IMDM培养液中，调细胞浓度为1.0×107/ml。
②加样：取胸腺细胞加入96孔细胞培养板，0.1ml/well。再加入IL-1待测样品或IL-1标准品，50ul/well，实验孔再加入50ul ConA（终浓度0.625ug/ml），同时设培养液对照孔（0.1ml细胞+0.1ml培养液）、ConA对照（0.1ml细胞+50ul培养液+50ul ConA），均设3复孔。37度，5% CO2孵育36~60小时。
③3H掺入：每孔加1.85×1010uBq/20ul（0.5uCi/20ul）3H-TdR，继续培养8小时。
④测定：多孔细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用β液体闪烁仪测定3H-TdR
掺入量（cpm）以净cpm值（实验孔- ConA对照孔cpm值）为纵坐标，对应的不同稀释浓度IL-1标准品为横坐标，在半对数图纸上绘制出标准曲线，再从标准曲线上查出待测样品中的IL-1含量。
关键点
（1）吸取LPS刺激的小鼠巨噬细胞培养上清时，必须离心，以除去细胞及细胞破碎成分。
（2）ConA应选择淋巴细胞转化实验的亚剂量，即选择能够激活胸腺细胞，又不引起明显增殖的量，如果ConA过量，则不能有效反应IL-1的刺激活性。

二、IL-2生物学活性检测
白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。
试剂与材料
（1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。
（2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4度避光保存。
（3）IL-2标准品。
（4）PHA（200ug/ml）。

操作流程
（1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生：
①人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为
加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37度，5% CO2孵育48小时。
③回收上清：吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。
（2）IL-2生物活性测定
①CTLL-2细胞制备：取传代培养24~48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。
②加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1ml，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔（100ul细胞+100ul培养液）。37度，5% CO2孵育40小时。
③MTT掺入：轻轻吸取上清液100ul，加MTT（1mg/ml）100ul，37度，5% CO2孵育2小时。
④测定：离心培养板，2000r/min，5分钟，吸弃上清液，每孔加100ulDMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570nm测吸光值（A）。
⑤计算：用标准品浓度和对应的净A570nm值（实验孔-阴性对照孔的A570nm值）绘制标准曲线。根据标准曲线求出待测样品IL-2水平。

关键点
（1）CTLL-2细胞存活率应大于95%。
（2）因标本中含IL-4等，可影响IL-2的测定，最好采用抗IL-4mAb吸附剂除去IL-4。

三、IL-4生物学活性检测
IL-4主要是由TH细胞活化后产生的一种细胞因子。CT.4S细胞为IL-4的依赖细胞株，对IL-2呈现低反应性，其增殖反应与IL-4的活性呈正相关系。检测IL-4的生物学活性水平，可间接了解TH2细胞及与抗体介导的一些体液免疫的功能。

试剂与材料 CT.4S细胞株，A23187（钙离子载体）（用生理盐水配制成0.1ug/ml浓度）。其他同IL-2测定。

操作流程
（1）IL-4诱生
①人PBMC分离：淋巴细胞分层液常规分离PBMC，用10%FCS-IMDM培养液调细胞浓度为1×106/ml。
②加样：将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。再分别加0.25mlPHA（200ug/ml）和0.25A23187（0.2ug/ml），37度，5% CO2孵育24小时。
③回收上清：将细胞培养板1500r/min离心10分钟，收集细胞培养上清液，-30度冻存。
（2）IL-4生物学活性测定
 

四、IL-6生物学活性检测
MH60.BSF2为IL-6依赖细胞株，MH60.BSF2细胞增殖量同IL-6的生物学活性呈正相比。

试剂与材料 同IL-2的生物学活性检测。

操作流程
（1）IL-6的诱生：诱生过程与IL-2基本相同。用于诱导产生IL-6的细胞可用PBMC。诱生剂用PHA。
（2）IL-6的生物学活性测定：采用MH60.BSF2细胞增殖法，测定过程IL-2。应用的MH60.BSF2细胞浓度为2×105/ml。

五、IL-8生物学活性检测
IL-8 中对中性粒细胞具有激活和趋化作用，通过检测中性粒细胞的迁移距离可以确定IL-8的生物学活性，即对中性粒细胞的趋化活性。

试剂与材料
（1） 6%右旋糖酐生理盐水溶液。
（2） 淋巴细胞分层液比重为1.077+（-）0.001。
（3） 2%琼脂糖：称取2g琼脂糖，加入到100ml蒸馏水中，煮沸溶解。
（4） 0.1%白明胶Hank’s液。
（5） DMEM培养液（2×浓缩），内含20%FCS和0.75mg/mlNa2CO3溶液。
（6） 甲醇溶液、Wright-Giemsa染液。
（7） 洁净载玻片。
（8） 打孔器，直径为3mm。

操作流程
（1）IL-8的诱生
① 常规分离PBMC，洗涤后，调细胞浓度为5×106/ml。
② 将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。
③ 加诱生剂LPS（20ug/ml），每孔0.5ml，37度，5% CO2孵育48h。
④ 离心收集细胞培养上清液，用HCl溶液调为酸性（PH4.0），经SephadxG-75柱分离，收集活性组分即为待测的IL-8粗品。
（2）IL-8的生物活性检测
① 琼脂板的制备；取溶化后50度左右保温的2%琼脂糖与等体积50度水浴预温的DMEM培养液（2×浓缩），混合，取3ml加到洁净的载玻片上，铺成薄层，室温凝固后，放4度，进一步凝固30~60分钟，红打孔器打孔。
② 中性粒细胞制备：常规分离人外周血中性粒细胞。
③ 加样：取10ul中性粒细胞悬液加入琼脂板各组中心孔，分别取10ul待检样品及阳性对照品加入样品孔，取10ulDMEM培养液加入对照孔；将玻片置于湿盒内，37度温育2小时。
④ 染色：用甲醇溶液固定30分钟，用瑞氏染液染片并干燥。
⑤ 检测：显微镜下分别测量细胞从中心孔向样品孔游走的距离（趋化游走距离）及向阳性对照孔的游走距离（自发游走距离），趋化 活性以趋化指数表示。
趋化指数=趋化游走距离/自发游走距离

关键点 为确认待检样品中IL-8的特异性趋化效应，最好同时比较抗IL-8抗体与待测样品作用后的趋化结果。

六、IL-10生物学活性检测
在小鼠IL-4（Mil-4）存在的情况下，IL-10可刺激D36小鼠肥大细胞株增殖。而单一的m IL4或h IL-10则仅有很低的增殖刺激活性。

试剂与材料
（1） 20%FCS-IMDM培养液，含8U/ml的rm 里减四。
（2）rh IL-10标准品。
（3）3H-TdR。
（4）D36小鼠肥大细胞株。
 

附 录

一.几种营养液，缓冲液和试剂的配制
1．10%NaHCO3溶液：
取NaHCO3 10克加蒸馏水100毫升，高压灭菌1.5磅/10分钟
即可使用
2．Hanks液：
原液甲 NaCl 160 克
KCl 8克
MgSO47H2O 2克
MgCl26H2O 2 克
按顺序溶于800毫升双蒸馏水
CaCl2 2克
溶于100毫升双蒸馏水中
两液混合加双蒸馏水1000毫升，再加入2毫升氯仿做防腐剂。盖紧瓶塞。保存于4℃
原液乙 Na2HPO412H2O 304克
KH2PO4 1.2克
葡萄糖 20克
按顺序溶于800毫升双蒸馏水
0.4%酚红溶液 100毫升
将酚红液加到上述溶液中，加双蒸馏水1000毫升，再加入2毫升氯仿做防腐剂。盖紧瓶塞。保存于4℃
用时按原液甲 1份
原液乙 1份
双蒸馏水 1份
于10磅10分钟高压灭菌，4℃保存一个月。用前用5.6%碳酸氢钠调PH7.2—7.4，根据需要加青链霉素。
3．阿氏液 用于保存红细胞
葡萄糖（undefinedR级） 2.05克
柠檬酸钠 2水 0.8克
氯化钠 0.42克
无离子水或双蒸馏水100毫升
高压灭菌8磅20分钟，置于4℃冰箱内保存备用
4．小牛血清 （FCS）
购得的小牛血清必须先经过56℃，30分钟灭活后才可使用。应分装小瓶冰冻保藏，长期备用。
5.吸收过的胎牛血清
除去胎牛血清中对绵羊红细胞的嗜异性抗体，可取经56℃30分钟加热灭活的小牛血清，加半量压积绵羊红细胞，混合后，37℃水浴20分钟。水浴后，2000转每分钟，10分钟。吸取上清液即成。
6．肝素溶液
将注射用的肝素（每支含12500单位）。用无菌生理盐水稀释成250单位每毫升。放4℃保存，使用时取2滴（约含25单位）可抗凝1毫升全血。
7．1%硫柳汞
硫柳汞 1克
丙酮 10毫升
乙醇 50毫升
溶解后加蒸馏水至100毫升
8．玻璃器皿清洗液
稀浓度：重铬酸钾 50克
自来水 850毫升
浓硫酸 100毫升
浓浓度：重铬酸钾 4克
自来水 160毫升
浓硫酸 800毫升
重铬酸钾加匀后加热搅拌溶解，冷却（不能让重铬酸钾结晶析出）倒入教大的器皿（瓷钵等）内将器皿放入冷水中。再将浓硫酸缓慢加入，边加边搅拌，最初加的100—200毫升浓硫酸要求特别慢，待全部浓硫酸加完后，配好的洗液应呈酱色，无红色结晶物析出。