细胞因子的生物活性检测法

不同的细胞因子有其特有的生物学活性。细胞因子的生物活性检测法是利用细胞因子对特定细胞株（靶细胞或反应细胞）的生物学效应来评估样本中相应细胞因子的含量和/或活性。生物活性检测法所用的靶细胞可直接从组织中分离，如骨髓细胞的集落形成试验和胸腺细胞(脾细胞)的增殖试验，或用体外培养的依赖细胞因子才能生长的细胞因子依赖株及对细胞因子杀伤敏感的细胞作为靶细胞其测定方法可分为促进细胞增殖和增殖抑制法、抗病毒活性测定法、集落形成法、趋化作用测定法及细胞因子诱导产物测定法等。

1、促进细胞增殖和增殖抑制法：

目前已建立的应用依赖细胞株检测各种细胞因子的方法，其操作过程基本相同。检测细胞因子促生长活性或抑制生长活性是将不同稀释度的待测样品或细胞因子标准品与培养的细胞株共同培养一定时间，然后检测增殖的细胞数。前者的增殖细胞数与细胞因子的含量成正比，而后者的增殖细胞数与细胞因子的含量成反比。

常用的检测细胞增殖的方法有3 H-TdR掺入法、比色法、染色法和直接计数法等。其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括 MTT、XTT、MTS和NAG等方法，可在酶标检测仪上自动化检测，且不接触同位素，较为常用。

此外，测定代谢产物荧光强度的方法也可检测增殖细胞数，如ATP法和cAMP法。细胞因子还能诱导靶细胞表达某些表面分子或分泌一些蛋白质，可以用荧光素标记抗体检测表达相应分子的细胞数，或用特定方法测定细胞分泌的蛋白质，间接了解细胞因子的活性。

各种集落刺激因子(CSF)作用于造血系统的不同细胞，可促进其增殖及在半固体琼脂凝胶系统中克隆培养骨髓细胞的集落形成，故可采用集落形成试验研究CSF的水平。

2、细胞毒活性测定法：

许多细胞因子针对转化的细胞及病毒感染的细胞具有溶细胞或抑制细胞生长的活性。检测细胞因子溶细胞/细胞毒活性或抑制生长活性是将不同稀释度的待测样品或细胞因子标准品与培养的细胞株共同培养一定时间，然后检测存活的靶细胞数，并与对照比较求得溶细胞或抑制细胞生长的百分率，或以OD值对样品稀释度作图，绘制标准品的剂量反应曲线，从曲线上求得引起相应反应的待测样品的含量。检测活靶细胞数的方法同促细胞增殖法。

3、抗病毒活性测定法：

检测样品中干扰素的含量最常用的方法是检测其抗病毒活性，其检测原理是用细胞因子样品处理易感细胞，使细胞建立抗病毒状态，然后用适量病毒攻击细胞，评价病毒的复制量或病毒引起细胞病变的程度即可判断样品中细胞因子的生物活性。常用于检测抗病毒活性的细胞株有WISH，Hep2/c，L929，A549和MDBK等。其中WISH和Hep2/c细胞株用以检测人干扰素，L929细胞株用于检测小鼠干扰素，Ratec细胞株用于检测大鼠干扰素，而MDBK细胞株则可用于检测多种族的IFN-α和IFN-γ。

常用于攻击细胞的病毒有滤泡性口炎病毒(VSV)、鼠脑心肌炎病毒(EMCV)以及Sindbis virus等病毒。检测抗病毒活性的具体方法包括测定细胞因子抑制病毒的致细胞病变效应(CPE)、抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量等。 IFN的抗病毒活性通常以每毫升样品中所含的单位数(U/ml)表达，IFN的纯度则以每毫克蛋白质中所含的单位数(U/mg)或IFN的量(μg/mg)表达。IFN抗病毒活性单位的定义是指能抑制50％细胞病变或50％病毒空斑形成效应的IFN最高稀释度的倒数。

4、趋化活性测定法：

多种细胞因子具有趋化活性，分别能诱导中性粒细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞等定向迁移。趋化因子诱导细胞移动的方式包括趋化性和化学增活现象。趋化性(chemotaxis)是指诱导细胞向趋化因子化学浓度高的方向作定向移动，可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验测定细胞因子的趋化活性；化学增活现象(chemokinesis)是指增强细胞的随机运动，可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。

生物活性检测法敏感性往往高于细胞因子的免疫学检测法，且不需要各种标记的特异性抗体，可直接反映待测细胞因子的活性水平。用生物学活性检测法得到的细胞因子含量一般以活性单位来表示。

但本法易受多种因素的干扰（如某些细胞因子抑制物、其他细胞因子、反应条件等），且不能区分样本中某些具有相似或相反生物学效应的细胞因子；长期培养的靶细胞（反应细胞）敏感性可发生变异或所使用的不同靶细胞对同一种细胞因子的较敏感性存在差异等。使检测结果难以统一标准。同时，因大多数细胞因子在体液中含量甚少，难以直接测定，一般均需要先进行体处诱导细胞因子产生，才能进行上述细胞因子活性检测。