原理
Lowry 法又称为 Folin-酚试剂法。首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物,然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂 (Folin-酚上级),产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色,这种深蓝色 的复合物在745~750 nm 处有最大的吸收峰,颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比,可根据 750nm 的光吸收值大小计算蛋白质的含量。
材料与仪器
五水硫酸铜 柠檬酸 碳酸钠 NaOH Folin-酚试剂
分光光度计 比色杯 移液管 枪头和加样枪 试管(3~5 ml) 试管架 震荡器
步骤
1. 溶液
1.1 溶液 A,100 ml
0.5 g CUSO4·5H2O
1 g Na3C6H5O7(·2H2O)
加双蒸水至 100 ml, 溶液可长期保存于室温。
1.2 溶液 B,1L
20 g Na2CO3
4 g NaOH
加双蒸水至 1 L, 溶液可长期保存于室温。
1.3 溶液 C,51 ml
Folin 溶液A
50 ml 溶液B
1.4 溶液 D,20 ml
10 ml Folin-酚试剂
10 ml 双蒸水
2. 检测
2.1 用双蒸水稀释样品至 0.5 ml;
2.2 加 2.5 ml 溶液 C;
2.3 混匀在室温下放置 5~10 min;
2.4 加 0.25 ml 溶液 D, 混匀;
2.5 20~30 min 后,在分光光度计上测 A750 值。
3. 从干扰物质中纯化蛋白质样品的附加步骤
脱氧胆酸-三氯醋酸(DOC-TCA)沉淀法。此法可在测定蛋白质的溶液浓度低于 1 ug/ml 情况下使用。
所需试剂:0.15 % (w/V)DOC:72 % TCA
3.1 于 1 ml 蛋白质样品中加入 0.1ml 0.15 % DOC;
3.2 震荡后在室温放置 10 min;
3.3 加入 0.1 ml 72 % TCA, 摇匀后,1000~3000×g 离心 5~30 min。如使用固定角转头,以及低温或大体积则需较长时间离心;
3.4 倾斜,吸弃上清液;
3.5 直接用溶液 C 溶解沉淀。
注意事项
1. 在加入试剂 20~30 min 后呈色达到饱和,此后每小时颜色信号减弱 1 %。
2. 许多干扰物质降低颜色反应,而去垢剂引起颜色轻微升高。
3. 高浓度盐可引起沉淀。
4. 氯仿抽提可去除溶液中的脂质,在 K+ 或 Triton X-100 存在时可通过离心去除混浊物。
5. 去垢剂,蔗糖和 EDTA 的干扰可通过在 Lowry 试剂中加入 SDS 来消除。
6. —般情况下,蛋白质-染料复合物的消光系数 ≤ 1.2。
来源:丁香实验