丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

Lowry检测法

相关实验:Lowry 检测法测定蛋白质浓度实验

最新修订时间:

原理

Lowry 法又称为 Folin-酚试剂法。首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物,然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂 (Folin-酚上级),产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色,这种深蓝色 的复合物在745~750 nm 处有最大的吸收峰,颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比,可根据 750nm 的光吸收值大小计算蛋白质的含量。

材料与仪器

待测蛋白质样品
五水硫酸铜 柠檬酸 碳酸钠 NaOH Folin-酚试剂
分光光度计 比色杯 移液管 枪头和加样枪 试管(3~5 ml) 试管架 震荡器

步骤

1. 溶液


1.1 溶液 A,100 ml

0.5 g CUSO4·5H2O

1 g Na3C6H5O7(·2H2O)

加双蒸水至 100 ml, 溶液可长期保存于室温。


1.2 溶液 B,1L

20 g Na2CO3

4 g NaOH

加双蒸水至 1 L, 溶液可长期保存于室温。


1.3 溶液 C,51 ml

Folin 溶液A

50 ml 溶液B


1.4 溶液 D,20 ml

10 ml Folin-酚试剂

10 ml 双蒸水


2. 检测


2.1 用双蒸水稀释样品至 0.5 ml;


2.2 加 2.5 ml 溶液 C;


2.3 混匀在室温下放置 5~10 min;


2.4 加 0.25 ml 溶液 D, 混匀;


2.5 20~30 min 后,在分光光度计上测 A750 值。


3. 从干扰物质中纯化蛋白质样品的附加步骤

脱氧胆酸-三氯醋酸(DOC-TCA)沉淀法。此法可在测定蛋白质的溶液浓度低于 1 ug/ml 情况下使用。

所需试剂:0.15 % (w/V)DOC:72 % TCA


3.1 于 1 ml 蛋白质样品中加入 0.1ml 0.15 % DOC;


3.2 震荡后在室温放置 10 min;


3.3 加入 0.1 ml 72 % TCA, 摇匀后,1000~3000×g 离心 5~30 min。如使用固定角转头,以及低温或大体积则需较长时间离心;


3.4 倾斜,吸弃上清液;


3.5 直接用溶液 C 溶解沉淀。

注意事项

1. 在加入试剂 20~30 min 后呈色达到饱和,此后每小时颜色信号减弱 1 %。


2. 许多干扰物质降低颜色反应,而去垢剂引起颜色轻微升高。


3. 高浓度盐可引起沉淀。


4. 氯仿抽提可去除溶液中的脂质,在 K 或 Triton X-100 存在时可通过离心去除混浊物。


5. 去垢剂,蔗糖和 EDTA 的干扰可通过在 Lowry 试剂中加入 SDS 来消除。


6. —般情况下,蛋白质-染料复合物的消光系数 ≤ 1.2。

来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序