细胞内（胞浆）细胞因子的免疫学检测法

基本原理

基本原理是应用荧光素标记的特异性抗细胞因子单克隆抗体，借助FCM免疫荧光技术（如FACS）即可从单细胞水平检测不同细胞内的细胞因子，并由此可判断产生特定细胞因子的细胞种类、细胞定位，分布密度及细胞因子与组织病变的关系等。

也可将细胞裂解后，应用ELISA、RIA等技术检测细胞与细胞因子水平。现以FCM免疫荧光法检测人PBMC内的细胞因子为例加以简单介绍。

操作步骤

1. 人PMBC：常规分离人PBMC，用含10%小牛血清，50μmol/L 2-巯基乙醇、1mmol/L丙酮酸钠的RPMI-1640完全培养液将PBMC调浓度为2×106 /ml；

2. 细胞培养与收集：取6孔细胞培养板，加上述细胞悬液，2ml/孔，并加入2μmol/L莫能菌素（monensin，抑制细胞分泌细胞因子）、1μmol/L艾罗雯素（ionomycin）和20ng/ml PMA刺激细胞产生细胞因子。

在37℃，5%CO2 培养箱中培养适当时间，根据实验需要，可用不同方法刺激细胞诱导细胞产生细胞因子。用4℃PBS洗涤细胞1次，留下少许液体用于悬浮细胞，使细胞完全分散于离心管中；

3. 细胞固定（可固定细胞内的细胞因子）：于每管中加入4%多聚甲醛（用PBS配制，置37℃预温）3ml，充分混悬细胞，固定5min。

再加入0.1% BSA-PBS 12ml，混匀以终止反应。1500r/min离心10min，去上清液后进行封闭和染色；亦可用1ml含10%DMSO（二甲亚砜）的PBS悬浮细胞，分装保存于-80℃冰箱备用；

4. 封闭非特异性结合位点：取上述固定的细胞（或复苏冻存的细胞，用0.1% BSA-PBS洗涤细胞2次），用悬浮液（含5%脱脂奶粉的PBS-Ca-Mg：lmmol/L Ca2+ 、lmmol/L Mg2+ 、 0 .1%皂角苷和0.1%BSA的PBS）悬浮细胞至106 /100μl。

室温下作用1h，封闭非特异性结合位点，并增加细胞膜的通透性，以利于荧光素标记的抗细胞因子单克隆抗体能进入细胞内与胞浆中的细胞因子特异性结合。

取96孔塑料软板或 V型底离心管，每孔（管）加入上述细胞悬液20μl，离心去上清。用悬浮液稀释不含特异性抗体的同种抗体0.1mg/ml以封闭非特异性结合位点；同样将未标记的荧光素的抗细胞因子单克隆抗体稀释至0.1mg/ml。

分别于每孔（管）中加入50μl同种抗体（为染色试验管）、未标记荧光素的单抗或含100-1000倍量细胞因子的悬浮液（未标记荧光素的单抗或过量的细胞因子可以封闭特异性结合位点，作为阴性对照）。置室温1h。

5. 染色与分析：再加入荧光素标记的抗细胞因子单抗于各管中，4℃下作用30min，用PBS -Ca-Mg洗涤细胞3次（增加细胞通透性），将细胞悬浮于0.1%BSA-PBS中，即可进行FCM分析，从单细胞水平检测不同细胞内（胞浆）的细胞因子种类和含量。