免疫学检测法

 

二、免疫学检测法

免疫学检测法的基本原理是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。这类方法的优点是实验周期短，少受抑制物或相似生物池功能因子的干扰，如抗体的特异性高可区分不同型或亚型的细胞因子（如IFN），一次能检测大量标本，易标准化。与生物学活性检测方法相比，免疫学检测法在许多情况下敏感性低于前者，所得结果不表示生物学活性，有的McAb只能识别重组的细胞因子，在检测天然的细胞因子中受到限制。

免疫学检测的方法多采用ELISA和RIA法，可以分为平心法、竞争法和间接法。

（一）ELISA（或RIA）平心法

根据抗体性质和特异性不同可有以下几种不同的平心法ILISA。

1.PcAb与McAb夹心法　用纯化的多克隆抗体（PcAb）包被板子，加待检细胞因子（或可溶性受体）和标准品，上层加酶标记的McAb。有时为了增加敏感性，上层加McAb后再用酶标记第二抗体显色。

2.McAb与PcAb夹心法　用McAb包被板子，加待检样品，上层加酶标记的PcAb。有时为了增加敏感性，上层加PcAb后再用钊对PcAb的酶标记抗抗体。

3.双McAb夹心法 选择和应用识别同一个细胞因子（或受体）分子上不同表位的两种McAb，其中一种包被板子，另一种McAb标记酶。由于单克隆抗体亲和力识别表位地匀一，从质量控制角度来看，一般比上两种夹心法易控制。如目前已商品化检测细胞因子（或其受体）的检测盒大多采用双单克隆抗体夹心法。

　　4.细胞、McAb夹心法 用表达IL-2R的MT-1细胞包被板子，加入待检IL-2或标准品，上层加 ¹²⁵ I标记的McAb，根据γ计数cpm值推算出待检IL-2含量。

（二）竞争法

　　有报道用况争法检测IL-2水平。用免抗IL-2PcAb包袱板子，同时加入 ¹²⁵ I标记的IL-2和待测IL-2，根据γ计数cpm值得知待检IL-2对 ¹²⁵ I-IL-2与PcAb竞争结合的程度，从而推算出待测标本IL-2的含量。这种方法检测IL-2的敏感性可达50pg/ml。

为了增加敏感性，在上述系统中可再连接上生物素，再用链霉亲和素（streptavidin）酶标记物进行放大。此外，还可用化学发光、改进显色底物等措施提高检测方法的敏感性。

表4-23 细胞因子生物学活性与免疫学检测方法的比较

　 生物学活性法 免疫学检测法 原理 细胞因子特定的 细胞因子与相应抗体 　 生物学活性 特异性结合反应 结果表示 生物学活性水平 含　量 敏感性 一般较高 一般较低 　 （与细胞表面高亲和力受体有关） （加放大系统可明显升高） 特异性 低 高 （识别类型、亚型） （不能） （不可能） 周　期 较　长 短 受实验条件影响 　 　 　　培养条件 大 小 　　指示细胞敏感性差异 大 ／ 　　指示细胞突变 可发生 ／ 　　生物学作用相同因子干扰 大 小 　　样品中特异性或非特异性 大 小　 抑制物干扰 　 　 　　重复性 较　差 较　好 标准化、大量检测 困　难 容　易