朊粒病的免疫学方法检测 PrPSc

肮粒(Prion,PrPS)又名脉病毒、肮毒体， 是一类由宿主细胞基因编码， 构象异常的蛋白，其不含核酸， 抵抗力强， 具有自我复制能力和传染性， 可引起多种哺乳动物发生传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies,TSEs)， 如羊瘙痒病、克雅病、库鲁病、疯牛病等。目前在人类及 20 余种动物中发现有 10 多种自然发生或感染的玩粒病。

目前 Prr5 免疫学检测方法主要包括免疫组织化学法、免疫印迹和酶联免疫吸附等。

免疫组织化学法(IHC)方法的基本原理是组织切片上的抗原抗体反应。该方法能检出 PrP， 还能体现 PrP在脑中的组织分布特点。免疫印迹法(WB)是目前确诊肮粒病的常用方法。通过检测脑组织和脊髓匀浆中与广谱 PrP 单抗结合的 PrP 蛋白对蛋白酶K的抵抗力和分子量大小来判定诊断结果，并可实现对不同类型 （毒株）进行分型，酶联免疫吸附法(ELISA)主要用于脑组织和脑脊液中 Pr 的筛查。借助不同种属动物产生针对人 PrP 蛋白的特异性抗体， 检测患者标本中的 PrP。

器材：组织切片、脑组织、脑脊液

朊粒病的免疫学方法检测 PrPSc 的实验步骤如下：

1. 免疫组织化学法（IHC）。该方法不仅能够检出 PrP～， 还能体现PrP在脑中的组织分布特点， 是目前确诊肮粒病最可靠的诊断方法。其原理为组织切片上的抗原抗体反应。IHC检测脑组织中 PrP 的基本步骤如下：

①醋酸处理→②甲醛固定→③包埋、切片→④高压蒸汽处理→⑤内源性过氧化物酶去除→⑥切片抗原抗体反应（一抗、二抗）→⑦显色→⑧淡染细胞核→⑨脱水封片， 镜检。

在样品固定阶段， 选择适当的固定时间、固定液浓度和体积以最大限度地保存组织细胞的抗原性； 在高压蒸汽处理阶段， 通过热效应来充分破坏 PrP 并暴露 PrP， 使抗原决定簇暴露。高压蒸汽处理对实验结果至关重要， 关键因素包括：①温度：＞ 100 ℃；②时间：3～15 分钟；③修复液 pH：7.5～8.5。

接下来， 再利用 PrP 单抗与组织中的 Pr 产结合。在显色阶段， 因样品不同， 抗原含量不等， 显色时间可有一定差异。最后，分别在低倍， 高倍镜下观察 Pr 蛋白沉积， 凡在灰质区出现成片的暗红色染色颗粒的判为阳性。

2. 免疫印迹法(WB)。WB是目前确诊肮粒病的常用方法。通过检测脑组织和脊髓匀浆中与广谱 PrP 单抗结合的 PrP 蛋白对蛋白酶K的抵抗力和分子量大小来判定诊断结果，并可实现对不同类型（毒株）进行分型， 是目前多家国际机构认可的 PrP 常规检测方法。该方法具有良好的灵敏度和特异性， 但受到如蛋白酶K的浓度和作用时间， 所用抗体种类等因素的影响， 其中样品采集和蛋白提取是确保实验结果的关键。这种方法不仅可以对 PrP～ 进行特异性检测， 还能测 Pr 在不同糖基化状态下的分子量， 结合基因序列分析， 对阮粒病进行基因分型。

3. 酶联免疫吸附法(ELISA)。 ELISA 主要用于脑组织和脑脊液中 PrP 的筛查。借助不同种属动物产生针对人 PrP 蛋白的特异性抗体， 检测患者标本中的 PrP。目前常用 ELISA 夹心法或 ELISA 化学发光法对脑组织悬液或脑脊液中存在的 PrP 进行检测。