朊粒病的标本类型和处理

肮粒（Prion，PrPS ）又名脉病毒、肮毒体， 是一类由宿主细胞基因编码， 构象异常的蛋白，其不含核酸， 抵抗力强， 具有自我复制能力和传染性， 可引起多种哺乳动物发生传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies，TSEs）， 如羊瘙痒病、克雅病、库鲁病、疯牛病等。目前在人类及20余种动物中发现有10多种自然发生或感染的玩粒病。

传染性海绵状脑病（TSEs）即肮粒病， 是一种慢性退行性、致死性中枢神经系统疾病。不同来源的阮粒可呈现出明显的「毒株」差异， 如在潜伏期、临床特征， 神经病理表现以及玩粒的分子特征等方面有所不同。一般来说， 肮粒病共同特点包括：

① 潜伏期长， 可达数年或数十年；

② 发病后呈慢性、进行性发展， 死亡率100％；

③ 临床表现以痴呆， 震颤、共济失调等中枢神经系统症状为主；

④ 病理学特点表现为中枢神经系统神经元死亡， 弥漫性神经元缺失， 星状胶质细胞增生， 脑皮质疏松呈海绵状变性并有淀粉样斑块形成， 脑组织无炎症反应。

（一）标本类型

冻存脑组织

朊粒病的标本类型和处理的步骤有以下几步：

实验前， 取出冻存脑组织， 室温解冻后， 在生物安全柜中， 用采样器在脑干一侧采集神经组织， 称重定量。因肮粒病病原及其引起的损害的重点部位在脑干的延髓（脑门）， 故采样部位最好为延髓； 也可分别采集多部位（延髓、脑桥、中脑、丘脑、大脑皮质、小脑组织）同时检测。

采样完后另一半脑组织需完整保存于－80 ℃， 用于复检和确诊。在待测样本中加入 PBS 缓冲液， 通过匀浆， 超声处理， 使之成为10％（WIV）的脑组织悬液。将一定量上述脑组织悬液与等体积预冷裂解缓冲液混匀， 低速离心后， 取上清液（即「样品产」） 进行蛋白酶 K 处理（如37 ℃ 消化 1 小时）， 以破坏对蛋白酶K敏感的 PrP。用苯甲基磺酰氟（PMSF）终止蛋白酶K反应后所获得的样品即为「样品一」。

此外， 还可采用甲酸、SDS 等处理标本提取物， 以促进 PrPS 分子表位的暴露， 再进行抗原抗体反应。

① 所有样品的处理过程均需遵守相关生物安全规程， 如标本处理需要在 2 级或 3 级生物安全柜中进行； 操作中尽量避免气溶胶产生， 避免刺伤、划伤。

② 由于不同类型阮粒病的脑组织 PrP「含量不同， 对蛋白酶 K 的抵抗力也不相同。因此， 除了对蛋白酶 K 消化条件进行优化外， 还应在实验前对样本进行初步判断， 以确定蛋白酶 K 的用量。例如： 对于 sCJD 患者， 蛋白酶 K 工作浓度一般为 20 ug/ml， 时间为 1～2 小时， 而对于 FFI 患者， 蛋白酶 K 的工作浓度一般为 5 ug/ml， 且消化时间不超过 30 分钟。

③ 待测样本应与阳性对照（疯牛病牛脑组织）阴性对照（健康牛脑组织）同时处理。