限制性内切酶法检测 TALEN 活性

TALEN 质粒构建好后，在进行动物或细胞操作前，最好检测其活性，确保 TALEN 的有效性，及减少后续筛选突变体的工作量，TALEN 活性越高，后续的筛选突变体的工作量越少。常用的检测 TALEN 活性的方法有以下 3 种：luciferase SSA 法、非配对内切酶法-T7E1 法和限制性内切酶法。

限制性内切酶法的技术原理：在 TALEN 靶点位置中间序列 Spacer 中有限制性内切酶切位点，如 Hind III。如果通过 TALEN 发生了突变，这个位点将可能被破坏，而不能被 Hind III 酶切；同时野生型的细胞不受影响，仍可被 Hind III 酶切。

器材：

①凝胶电泳仪

②水浴锅

③低温离心机

④培养箱

⑤PCR 仪

试剂：

①DNA 聚合酶

②卡那霉素；氯霉素；潮霉素

③培养基

④DNA 连接酶

⑤琼脂糖凝胶

限制性内切酶法检测 TALEN 活性的主要操作步骤如下：

1）把 TALEN 质粒对共转染到相应的细胞系中，48 小时后提取基因组 DNA，然后 PCR 扩增目标 DNA 片段，或直接用细胞裂解液进行 PCR（参考唯尚立德公司的 easy PGenotyping Kit 试剂盒，货号：WS009）。

2）PCR 产物分成两组：突变体的细胞 PCR 和 wild-type 细胞 PCR，纯化 PCR 产物，定量。

3）用 Hind III 酶切 PCR 产物。凝胶电泳分离 DNA。判断是否有无法酶切的 DNA 产物，并计算 TALEN 造成的突变率。

3．PCR 产物测序 PCR 实验个体的基因组 DNA，如果 PCR 产物仅有一条带，可直接送去测序，如果有杂带，回收目标带送去测序。结合测序的序列结果和测序的峰形图，判断是否发生了突变。判断标准如下：

（1）如果读取的主峰 DNA 序列与野生型不同，可知道 TALEN 造成了突变；