影响限制性内切酶活性的因素

互联网2013-11-15

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1 DNA 纯度
在 DNA 样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、 EDTA 、 SDS 、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。

2  核酸内切限制酶的缓冲液
核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、 Tris-HCL 、巯基乙醇或二硫苏糖醇 (DTT) 以及牛血清白蛋白 (BSA) 等。
使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液。
不同限制性内切酶对 NaCl 浓度的要求不同，这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液，在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同，可采用以下三种方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化 DNA ，然后补足适量的 NaCl ，再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；
先用一种酶进行酶解，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。

3  酶切消化反应的温度
DNA 消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是 37℃ ，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于 37℃ 。

4 DNA 的分子结构
DNA 分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的 DNA 比消化线性 DNA 用酶量要高出许多倍。
有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异。
限制性内切酶反应的终止 通常是采用 65℃ 条件下温浴 5min ；
加终止反应液（如 0.5mol/L 的 EDTA 使之在溶液中的终浓度达到 10 mol/L ）螯合 Mg2 ，以终止反应。