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luciferase SSA 法检测 TALEN 活性

相关实验:TALEN 的活性检测

最新修订时间:

简介

TALEN 质粒构建好后,在进行动物或细胞操作前,最好检测其活性,确保 TALEN 的有效性,及减少后续筛选突变体的工作量,TALEN 活性越高,后续的筛选突变体的工作量越少。常用的检测 TALEN 活性的方法有以下 3 种:luciferase SSA 法、非配对内切酶法-T7E1 法和限制性内切酶法。

原理

luciferase SSA 重组检测 TALEN 活性原理:一个终止子在 luciferase 的编码区中央(红色标记),luciferase 没有活性。为检测 TALEN 剪切活性,将一个 TALEN 的靶点位置序列插在终止子后(蓝色标记)。在 TALEN 的作用下,靶点位置产生 DSB,细胞通过同源重组方式修复 DNA,形成一个有活性的 luciferase。通过与参照的比值变化反映 TALEN 剪切的活性水平。

材料与仪器

器材:


①凝胶电泳仪


②水浴锅


③低温离心机


④培养箱


⑤PCR 仪


⑥电转仪


试剂:


①培养基


②卡那霉素;氯霉素;潮霉素


③限制性内切酶、DNA 连接酶


④琼脂糖凝胶

步骤

luciferase SSA 法检测 TALEN 活性的主要操作步骤如下:


1.将靶点位置序列插入报道载体 pSSA-Luc 的 BglII 和 XhoI 位点,构建 TALEN 特异报道基因质粒。


(1)合成包含 target site 的两条 Sense 和 antisense 的 oligos,并分别在 Sense 和 Anti-sense oligo 的 5'末 端添加 BglII 和 XhoI 酶切位点。两条 oligos 的碱基序列如下。Target Sense: 5'-GATCTTGGCTTTGATGCTGTTACTGGAGAATTCACTGTAAGTTAACCTAGTTCGA-3' Target Antisense: 5'-TCGATCGAACTAGGTTAACTTACAGTGAATTCTCCAGTAACAGCATCAAAGCCAA-3'


(2)合成 target site oligos 磷酸化处理利用下列反应体系,对合成的 oligos 进行磷酸化处理。


(3)磷酸化处理后的 target site oligos,退火变性复性形成 duplex。将上述磷酸化处理后的 sense 和 anti-sense oligos 混合,95℃5 分钟,自然冷却至室温。退火后形成的 DNA 双链序列为:
5'-GATCTTGGCTTTGATGCTGTTACTGGAGAATTCACTGTAAGTTAACCTAGTTCGA-3'

3'-AACCGAAACTACGACAATGACCTCTTAAGTGACATTCAATTGGATCAAGCTAGCT


(4)BglII 和 XhoI 酶切载体 pSSA-Luc,凝胶电泳后切胶回收约 6.5kb 的片段。


(5)将退火后形成的 DNA 双链稀释至终浓度 0.25 μmol/L,取 1μl 复性后成双链的 oligos 和 1 μl 的回收的线性化载体进行连接 1~2 小时。


(6)转化含卡那霉素的 LB 培养基平板(Kan+),挑取单克隆,提取质粒后用下列引物(Lucup+lucdn)PCR 鉴定重组质粒。若测序,需用引物 Lucup+Lucdn 扩增质粒,将 PCR 产物送测序(注:不能把质粒 DNA 送去测序,否则是乱码,因为是存在重复序列)。


2.将特别报道基因质粒与 TALEN 质粒对共转染到人类 293 细胞系,24 小时后检查 luciferase 酶活性。


(1)将左右两边的 TALEN 质粒对、上述构建好的 reporter 质粒和内参质粒 Renilla luciferase 质粒按如下比例共转染到 24 孔板的细胞中(如 293 细胞系),每个实验重复 3 组,其中 control 组用其他无关质粒补齐 DNA 总量。

(2)转染 24 小时后裂解细胞,检测 luciferase 表达水平。

来源:丁香实验

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