luciferase SSA 法检测 TALEN 活性

TALEN 质粒构建好后，在进行动物或细胞操作前，最好检测其活性，确保 TALEN 的有效性，及减少后续筛选突变体的工作量，TALEN 活性越高，后续的筛选突变体的工作量越少。常用的检测 TALEN 活性的方法有以下 3 种：luciferase SSA 法、非配对内切酶法-T7E1 法和限制性内切酶法。

luciferase SSA 重组检测 TALEN 活性原理：一个终止子在 luciferase 的编码区中央（红色标记），luciferase 没有活性。为检测 TALEN 剪切活性，将一个 TALEN 的靶点位置序列插在终止子后（蓝色标记）。在 TALEN 的作用下，靶点位置产生 DSB，细胞通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活性的 luciferase。通过与参照的比值变化反映 TALEN 剪切的活性水平。

器材：

①凝胶电泳仪

②水浴锅

③低温离心机

④培养箱

⑤PCR 仪

⑥电转仪

试剂：

①培养基

②卡那霉素；氯霉素；潮霉素

③限制性内切酶、DNA 连接酶

luciferase SSA 法检测 TALEN 活性的主要操作步骤如下：

1．将靶点位置序列插入报道载体 pSSA-Luc 的 BglII 和 XhoI 位点，构建 TALEN 特异报道基因质粒。

（1）合成包含 target site 的两条 Sense 和 antisense 的 oligos，并分别在 Sense 和 Anti-sense oligo 的 5＇末 端添加 BglII 和 XhoI 酶切位点。两条 oligos 的碱基序列如下。Target Sense: 5'-GATCTTGGCTTTGATGCTGTTACTGGAGAATTCACTGTAAGTTAACCTAGTTCGA-3' Target Antisense: 5'-TCGATCGAACTAGGTTAACTTACAGTGAATTCTCCAGTAACAGCATCAAAGCCAA-3'

（2）合成 target site oligos 磷酸化处理利用下列反应体系，对合成的 oligos 进行磷酸化处理。

3'-AACCGAAACTACGACAATGACCTCTTAAGTGACATTCAATTGGATCAAGCTAGCT

（4）BglII 和 XhoI 酶切载体 pSSA-Luc，凝胶电泳后切胶回收约 6.5kb 的片段。

（5）将退火后形成的 DNA 双链稀释至终浓度 0.25 μmol／L，取 1μl 复性后成双链的 oligos 和 1 μl 的回收的线性化载体进行连接 1～2 小时。

（6）转化含卡那霉素的 LB 培养基平板（Kan+），挑取单克隆，提取质粒后用下列引物（Lucup＋lucdn）PCR 鉴定重组质粒。若测序，需用引物 Lucup＋Lucdn 扩增质粒，将 PCR 产物送测序（注：不能把质粒 DNA 送去测序，否则是乱码，因为是存在重复序列）。

2．将特别报道基因质粒与 TALEN 质粒对共转染到人类 293 细胞系，24 小时后检查 luciferase 酶活性。

（1）将左右两边的 TALEN 质粒对、上述构建好的 reporter 质粒和内参质粒 Renilla luciferase 质粒按如下比例共转染到 24 孔板的细胞中（如 293 细胞系），每个实验重复 3 组，其中 control 组用其他无关质粒补齐 DNA 总量。

（2）转染 24 小时后裂解细胞，检测 luciferase 表达水平。