三种方法检测IL-4活性

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IL-4可作为B细胞增殖的促进因子，1982年在T细胞培养 上清中首次被发现，1986年被成功克隆，并统一命名为白细胞介素4。IL-4除了可作为肿瘤免疫调节剂外，近来还发现可能其可能为败血症休克的治疗提供一个新的靶点。

1982年Howard在T细胞培养上清中发现一种促进B细胞增殖的因子， 起初命名为B细胞生长因子-1 (B cell growth factor-1, BCGF-1)。有的实验室称为B细胞刺激因子-1 (B cell stimulating factor-1, BSF-1)、T细胞生长因子-2 (T cell growth factor-2, TCGF-2)。1986年基因克隆成功，国际统一命名为白细胞介素4(interleukin 4, IL-4)。 IL-4对于B细胞、T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造细胞都有免疫 调节作用。

人类IL-4主要由活化T细胞产生。在小鼠由Th2亚群产生。人与鼠IL-4 DNA水平上有70%同源性， IL-4前体蛋白从N 端到91位氨基酸以及C 端到128位氨基酸人小鼠之间在氨基酸水平上有70%同源性，前体蛋白91至128位氨基酸之间很少有同源性，这可能与IL-4种属作用特异性有关，如人、 鼠IL-4生物学作用上没有交叉反应。

IL-4生物活性的检测方法：

1)用人外周血淋巴细胞检测人IL-4

1.用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞(PBMC)。用预温的RPMI-1640 培养液洗涤细胞两次，每次离心400×g 10分钟，去上清液。

2.用含5%小牛血清和1%(v/v)PHA的RPMI-1640培养液将细胞稀释至5×106/ml。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养48小时。加等量含5%小牛血清的RPMI-1640培养液到细胞培养瓶中，再加20U/ml IL-2，继续培养48小时。

3.用RPMI-1640培养液洗涤细胞两次，每次离心250×g 10分钟，去上清液。用含5%小牛血清和1%(v/v)PHA的RPMI-1640培养液将细胞稀释至2×105/ml。以每孔0.1ml将细胞悬液加入96孔细胞培养板的各孔。

4.倍比稀释IL-4标准品或待测样品，标准IL-4从100ng/ml稀释到0.1pg/ml(共12个稀释度)。每孔加0.1ml稀释样品，每个稀释度三个复孔，阴性对照孔不加IL-4。

5.在37℃ 5% CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养细胞48小时。

6.每孔加0.5μCi(18.5kBq)[3H]脱氧胸苷，继续培养18小时。

7.用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，液体闪烁计数仪计数细胞摄入的同位素活性，用cpm值对样品稀释倍数作图。比较标准品和待测样品的50%最大cpm值处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。亦可用MTT检测法。

2)检测IL-4抑制细胞增殖的活性

1.CCL-185细胞的培养：培养CCL-185细胞的培养液是含10%小牛血清、青霉素和链霉素的HAMs F12K培养液，将细胞置37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养至2×105/ml时分瓶到5×104/ml，继续培养。

2.用CCL-185细胞检测IL-4的生长抑制活性：

1)用上述细胞培养液倍比稀释待测样品的IL-4标准品，在96孔细胞培养板中每孔加入0.1ml稀释液，每个稀释度复孔2～3个。对照孔只加0.1ml培养液。

2)用细胞培养液洗涤CCL-185细胞后，将细胞配成1×105/ml悬液。每孔加0.1ml细胞悬液，置37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养16小时。

3)每孔加0.5μCi(18.5kBq)[3H]脱氧胸苷，继续培养4小时。

4)用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活性，用cpm值对样品稀释倍数作图。在图上，标准IL-4的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的S型。比较同样cpm处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。

3)用B细胞增殖反应检测IL-4

1.制备部分纯化的B细胞：取BALB/c或C57BL/6小鼠，无菌分离脾细胞。去除粘附细胞和T细胞，分离部分纯化的B细胞。洗涤细胞后，用细胞培养液将细胞培养液将细胞配成1×106～2×106/ml。

2.确定抗IgM抗体的亚适剂量

1)取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml B细胞悬液，加0.5U重组IL-4。

2)用细胞培养液系列稀释抗IgM抗体，每孔加0.1ml稀释液。每个稀释度设2～3个复孔。对照孔只加细胞培养液。

3)置37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养48～72小时。用[3H]脱氧胸苷掺入法或MTT法测定细胞增殖率。与对照相比，取加入IL-4后能引起明显细胞增殖的最低或接近最低的抗IgM抗体的稀释度为亚适剂量。

3.协同刺激实验

1)取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml B细胞悬液和0.05ml亚适剂量的抗IgM抗体。

2)用细胞培养液系列稀释IL-4标准品和待测样品，每孔加0.05ml稀释液。每个稀释度设2～3个复孔。对照孔只加细胞培养液。

3)置37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养48～72小时。用[3H]脱氧胸苷掺入法或MTT法测定细胞增殖率。

IL-4生物活性的检测方法包括了人外周血淋巴细胞检测、抑制细胞增殖的活性检测和B细胞增殖反应，另外由IL-4介导还能使肿瘤本身cathepsin B和cathepsin S活性增强，已成为肿瘤治疗的研究热点之一。