一种检测IL-4的方法
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实验原理
亚适剂量抗IgM抗体对B淋巴细胞的刺激较弱,当加人IL-4时,B淋巴细胞对亚适剂量抗IgM抗体刺激表现出明显的DNA合成增加,3 H-TdR掺人量与IL-4含量相关。
实验步骤
1. 小鼠脾脏B细胞悬液的制备
1) 取BALB/c或C57BL/6小鼠,常规方法分离脾脏淋巴细胞。用Hanks液洗2次;再用10%NBS-IMDM培养液调整细胞浓度为1X107 ~2X107 /mL。
2) 去除粘附细胞:将上述脾细胞悬液置24孔培养板,每孔1~1.5mL,置37℃,5%CO2 温箱中培养1h;将细胞悬液移至另外培养孔内,继续培养1h,收集非粘附脾细胞;亦可通过SephadexG-10柱去除粘附细胞。
3) 去除T细胞:调整细胞浓度至5X107 /mL,按1:40(V/V)加入抗小鼠T细胞血清或抗Thy-1,2McAb,置4~C 30min后,按1:15(V/V)加入新鲜豚鼠混合血清,充分混匀后温育1h;离心弃上清,用无血清培养液悬浮细胞。此时T细胞已死亡破碎,通过淋巴细胞分层液,低速离心予以去除。
4) B细胞的相对纯化:用淋巴细胞分层液500—800r/min离心6—8min,将上述细胞悬液再次纯化;用Hanks液洗1—2次,调整细胞浓度至1X106 —2X106 /mL。
2. 诱生上清IL-4含量的测定
1) 将上述B细胞悬液加入96孔培养板,100~tL/孔,分别加入待测IL-4诱生上清或不同量标准品rlL-4,其浓度为每毫升0.5U、1U、2U、3U、4U、5U、6U,各组均设3复孔。
2) 加亚适剂量抗IgM抗体,一般终浓度0.5%(V/V)为抗IgM的亚适剂量,也可在实验前自行测定。
3) 常规培养48~72h,结束前8-16h加入3 H-TdR,收获细胞测定cpm值;以标准品cpm值绘制标准曲线,从标准曲线上查出IL-4活性。
注意事项
1. B细胞纯度直接影响结果,B细胞悬液中若含有T细胞或死亡T细胞及其碎片,可影响试验结果。因此有人主张用Percoll不连续密度梯度离心,去除死细胞及碎片,可得到较高纯度的B细胞悬液。
2. 纯化B细胞悬液时,应尽量缩短操作时间,减少不利因素,保证细胞活力,使实验结果较稳定,重现性好。
3. 诱生细胞上清收获时间必须控制在30h左右。时间过长,上清中IL-4含量会降低。