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IL- 2 和 IL- 4 的检测实验

相关实验:IL-2 和 IL-4 的检测实验

最新修订时间:

材料与仪器

步骤

基 本 方 案 采 用 CTLL- 2 细 胞 检 测 小 鼠 IL - 2 和 IL -4

材 料

小鼠上清样品 重组小鼠 IL-2 (Amgen) 和 IL-4 (Genzyme) V R P M I -1 0 完全培养基 C T L L -2 T 细 胞 (A T C C ) 淋巴细胞 分 离 液 (LSM ; Organon Teknika Cappel) 3H TdR IL-2 封 闭 抗 体 (大鼠抗小鼠IL-2, S4B6; ATCC) IL-4封 闭 抗 体 (大鼠抗小鼠IL-4, 11B 11; A T C C ) 平 底 9 6 孔 板 (Costar) Srovall RT6000B 离心机及 50m l离心管 1•在9 6 孔板中,加 入 50/xl经 R P M I -I O 完全培养基稀释的样品上清及重组小鼠IL-2和 IL-4标 准 品 (一般进行5 倍稀释,从 1 0 % 〜0.016%)。每个样品做3 个复孔。 再次检测应使用同一批标准品来控制标准品每天的变化。 2 . 收集指数生长期的C T L L -2细 胞 (见 辅 助 方 案 2),放 入 50m l 离心管中,加 入 R P - M I -1 0 完全培养基至总体积为50m l 。室 温 , 335g 离 心 8min。倒去上清,用少量体 积的培养基重悬细胞(约 lml),再 补 加 R P M I -10培养基至总体积50m l 。重复洗涤2 次 。 3 . 用台盼蓝拒染法测定细胞活性(附 录 3 0 。如果细胞活力小于9 0 % ,用 L S M 离心细 胞来 富 集 活 细 胞 (单 元 2.1)。 4 . 用 R P M I -I O 完全培养基重悬细胞,并调整细胞密度为IXlO5个细胞/m l 。 5 . 在 9 6 孔板的每孔加入50M1 细胞悬液。用塑料盖盖住孔板以防止蒸发。放 入 37°C , 5 % C O 2培养箱中培养24h 。 6 . 加入3H T d R 继 续 培 养 24h (详 细 标 记 见 附 录 3E )。收获细胞,并 用 p 液闪仪测定 3H T d R 掺入值。 7 . 计算 总 T C G F 量 (见辅助方案1)。取半数最大刺激时的T C G F 浓度为l U /m l 。更精 确 计 算 5 0 % 活性的方法是将所得数据概率转换为直线图(GilUs M d . , 1978)。 8 . 按照步骤1 所述准备4 块 新 的 定 量 孔 板 (起始及终浓度相同)。 9 . 按照步骤2〜4 所 述 用 R P M I -I O 完全培养基洗涤并重悬C T L L -2细胞。将细胞分成4 份 放 入 4 个离心管。 10. 在 C T L L -2细胞中加入封闭抗体 。 一 个离心管中加入抗IL-2, 一个加入抗IL-4, 一 个同时加入这两种抗体,另一管不加任何抗体。 含 有 抗 IL-2 抗体的管测定IL- 4 特异性,反之亦然。含有两种抗体的管测定不 确定的淋巴因子诱导CTLL- 2 的增殖,这样可以检测所有的IL- 2 和 IL- 4 引起的生 物学活性,排除其他的诱导因素。 根据抗体活性确定所要加入抗体的浓度(封闭抗体浓度不变),通 过 100〜1000 倍改变相关纯化的或重组淋巴因子的农度来控制滴度曲线(图 5. 1. 1)。
图 5. 1 . 1 在 有 /无 抗 IL-4 ( I l B l l ) 和 抗 IL-2 (S 4 B 6 )的 情 况 下 C TLL 细 胞 对 含 有 IL-4和 IL -2 的 上 清 的 增 殖 反 应 。 上 清 以 5 倍 增 量 的 稀 释 度 稀 释 (从 1 : 1 0 稀 释 度 开 始 ), 分 别 加 人 至 5 X IO3个 C T L L 细 胞 (见 基 本 方 案 )。 48h 后 检 测 3H T dR 掺 人 值 , 以 总 cpm 值 表 示 。 1 1 . 在 9 6 孔板的每个孔中加入步骤8 中准备好的 50^1 CTLL- 2 细 胞 悬 液 (一块板应对 应一个离心管中的细胞),重复步骤5〜7。 1 2 . 通过比较总T C G F 单位数和封闭抗体存在下的T C G F 单位数来分别计算单独的IL- 2 和 IL- 4所诱导的TCGF。 例如,确 定 IL- 2 存 在 时 T C G F 的单位数比例是通过比
较 总 T C G F 和 抗 IL-4 存在时的 T C G F 单位数获得。通过比较抗 IL-4 抗体存在下的
T C G F 活性和两种抗体都存在下的 T C G F 活性的不同来计算 IL-2 活性。
IL-2 活性单位也可用已建立的小鼠 IL-2 标准计算得到。

备 选 方 案 1 采 用 CTLL-2 细 胞 检 测 人 IL -2

附 加 材 料

人血清或上清样品 重组人 IL-2 (A m g e n ) V P B S , H B S S ,或其他盐溶液 1 . 用 R M P I -10完全培养基稀释IL-2 标准品和样品。在 9 6 孔 板 中 加 入 IOOfXl标准品及 样品, 3 个复孔。培养基作为阴性对照,也作为样品中所存在的任何刺激因素(有丝 分裂原、抗原、佛波醇酯)的对照。 滴 定 IL-2标准品取能够使细胞达到最大D N A 合 成 的 最 低 稀 释 度 (通 常 20〜 40U /mlI L -2)。典型标准曲线的范围为20U /m l 到 低 于 0.3U /m l 。使用一致的标准 品稀释度减少各次C T L L -2反应间的变化。 培养上清稀释率用1 : 1、 1 : 2、 1 •• 4。如果最大刺激在1 : 4 时,则进行进一步 稀释。人血清样品可能需要进一步稀释,因为通常人血清含有IL-2抑制剂,会影响 测定结果。为了控制抑制剂的活性,用含有人血清和不含有人血清的R P M I -10稀释 重 组 IL-2标准品。 2 . 在最后一次换液后2d 收 集 C T L L -2细胞。用 P B S 洗 涤 细 胞 3 次 :细胞转到50m l 离 心管中,加入5〇 1111?88。 4。 (:, 335尽离心1〇 111丨11。弃 上 清 ,用 小 量 体 积 (约11111) 的 P B S 轻轻地重悬细胞沉淀,然后补足到50m l 体积。离 心 ,重 复 2 次 。用 2〜5ml R P M I -10完全培养基重悬细胞沉淀。 3 . 计数并用R P M I -10完全培养基调整细胞密度为5 X 104个细胞/m l 。在 9 6 孔板每个孔 中加入IOOiUl细胞悬液。 4 . 放 入 37°C , 5 % C O 2培养箱中培养28h 。如果培养箱中的湿度不够的话,孔板用塑料 盖盖住以防止液体蒸发。 5 . 在最 后 8h 加入3H T d R (附录3E )。收获细胞并用P 液闪仪测定3H T d R 掺 入 值 (附 录 3E )。 如果细胞经过相同时间的刺激并经过相同时间后收获,则这种检测方法具有较 高的重复性。

备 选 方 案 2 采 用 CT.4S 细 胞 检 测 小 鼠 IL -4

一 般 C T L L -2 细 胞 对 IL-2 有较好的应答,但 是 对 IL-4 的应答则时有变化。 C T L L -2 的变异亚系 C T .4S 细 胞 对 IL-4 有较强的应答,对 IL-2 的应答次之,对其他已知的细胞因 子 则 不 应 答(H u -L i ^ W . , 1989); 因此,使 用 C T .4S 可以高灵敏度地特异性检测 IL-4。 C T .4S 能用来从含有 lOOU/m l 的 IL-2 或其他细胞因子的样品中特异性地定量小 鼠 IL-4。无需使用单克隆抗体来中和 IL- 4 , 但 在确定由 IL- 4 引起的活性时则需要用到 。 C T .4S 细胞对人 IL-4 不应答。 C T .4S 细胞从 D n W .E . Paul 获 得(Laboratoryof
Immunology, National Insitute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, M D20892)。 C T .4S 细胞的培养见辅助方案 3。

备 选 方 案 3 采 用 CT.h4S 细 胞 检 测 人 IL -4

附 加 材 料

重组人 IL-4 (R & D Systems) C T .h4S 细 胞 (Dr. W .E . Paul, Laboratory of Immunology, National Insitute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda? M D 20892) V P B S 细胞刮 1. 稀 释 IL-4标 准 品 和 样 品 (见基本方案,步 骤 I)。 2 . 在最后一次换液后2d 收 集 C T .h4S 细胞,用细胞刮从培养瓶上刮下细胞。放 入 50ml 离心管,计 数 (附 录 3 0 。加 入 50ml P B S 洗 涤 1 次 , 4°C , 220g 离 心 lOmin。用 R P M I -I O 完全培养基重悬细胞并调整细胞密度为5X 104个细胞/m l ,置于冰上。 离心细胞时不要超过265尽,在没 有 IL- 4 时不要超过30min。 3 . 加 IOOm I细胞悬液到含有IL-4标准品、样 品 及 培 养 基 (阴性对照)的各个孔中。放 入 37°C , 5 % 0 ) 2培养箱中培养4811。 4 . 加人3H T d R 并 继 续 培 养 18h 。收 获 细 胞 并 用 P 液闪仪测定3H T d R 掺 入 值 (附录 3E )。

辅 助 方 案 1 白细胞介素或 T 细 胞 生 长 因 子(TCGF) 单位的计算

用 C T L L -2检测到的数据可以很好地通过概率分析进行处理,概率分析参照由国际 癌症研究所的生物应答调节计划(B R M P ) 提 供 的 标 准 IL-2制备物或者内部标准IL-2 制备物进行分析。在下面的例子中,使 用 B R M P 标准作为对照。 1 . 将样品3H T d R 掺 入 值 c p m 转换成最大c p m 的百分数。 2 . 将转换好的数据画成概率图(稀释率对最大计数百分数;图 5. 1 . 2 ) 或直接转换成对 数值。 3 . 将 X 轴转化成对照生长因子样品稀释率的Iog2形式。未稀释样品为0, X 轴上的稀释 率依次标记为1〜5。 4. ^ 轴 表 示 5 0 % 生 长 因 子 (F 5 q) 活性单位,为 样 品 的 F 5。/对 照 的 F 5。。 B R M P 对照在
图 5. I, 2 CTLL 细 胞 对 人 IL- 2 和 IL- 2 参 照 试 剂 BRMP的 增 殖 应 答 。 ^ 轴 上 的 5 0 % 活 性 时 在 : 9 处取得。因此, B R M P 对 照 稀 释 率 的 Iog2 为2 ^ 9或 3. 73, 3.73/3. 73 = 1U 活性。 rIL-2的 F 5 q的 ^ 值 为 3 ,同样的表示成指数形式为23 或 8。因此, rIL-2样品含有8/3.73或2.1411活性。 图 5. 1. 2 中比较了 B R M P 标 准 品 和 rIL- 2 样 品 (Cetus)。从图上可以得到 B R M P 标 准 品 和 rIL-2 样 品 最 大 D N A 合成的一半分别为7. 9U /m l 和 4U /ml。最大 D N A 合成一半时得到的不同数值,强调了在比较用多种检测方法检测样品时同一来 源的对照IL- 2 的重要性,也可能是每个试验室之间的差异导致的。

辅 助 方 案 2 小 鼠 CTLL- 2 细胞的维持

附 加 材 料

重组人 IL-2 (A m g e n )
75c m 2 组 织 培 养 瓶(Corning)
1 . 用 添 加 l U /m l 重 组 人 IL- 2 的 R P M I -I O 完全培养基维持连续增殖的 C T L L -2 细胞。
其 他 来 源 的 IL- 2 也 可 以 维 持 C T L L - 2 生 长 ,但 C T L L - 2 细 胞 的 增 殖 除 了 因 为 IL-2以 外 还 可 能 依 赖 于 其 他 来 源 的 生 长 因 子 ,这 在 生 物 检 测 中 会 产 生 较 高 的 背 景 应 答 。 2 . 以 0. 5 XIO5〜IXIO 6个细胞/m l 的接种密度将C T L L -2细 胞 用 25ml R P M I -I O 完全培 养基加到 75cm2培养瓶中培养。 3 . 收获细胞时用力吹打培养瓶使贴壁C T L L -2细胞脱落。 4 . 当密度达到IX IO 6个细胞/ m l 时 以 1 : 5 或 I : 1 0 传 代 (通常每周传代2 次)。 5 . 传代后至少2d 再使用细胞。 传 代 后 C T L L -2 细 胞 的 IL-2 受 体 会 立 即 饱 和 ,若 在 此 时 使 用 细 胞 会 导 致 高 背 景 且 降 低 灵 敏 度 。

辅 助 方 案 3 小 鼠 CT.4S 细胞的维持

附 加 材 料

75cm2组 织 培 养 瓶 (Corning) 1 . 用 添 加 lOOU/m l 重组 鼠 IL-4的 R P M I -10完全培养基维持连续增殖的C T .4S 细胞。 其他来源的1乙-4,如 用 (:〇 11八 刺 激 的 010.&4.11^2丁 细 胞 克 隆 (八丁(:0 的 上清,也可以维持C T .4S 细胞的生长,并且更加经济。 2 . 以 0 •5 X 105〜I X l O 6个细胞/m l 的接种密度将C T .4S 细 胞 用 15ml R P M I -I O 完全培 养基加到75cm2培养瓶中培养。 3 . 收获细胞时用力吹打培养瓶使贴壁C T .4S 细胞脱落。 C T .4S 细胞为贴壁细胞,在指数期收集细胞密度可达I X l O 6个细胞/m l 。 4 . 当密度达到I X l O 6个细胞/m l 时 以 1 : 5 或 I : 1 0 传 代 (通 常 每 周 传 代 2 次)。所有 洗涤及重悬细胞的操作要快速进行,因为细胞会重新贴壁。 5 . 传代后至少2d 再使用细胞。 和 C T L L -2 细胞一样,传 代后C T ,4S 细胞的IL- 2 受体会饱和

辅 助 方 案 4 小 鼠 CT.h4S 细胞的维持

C T .h4S 细胞的维持在C T .4S 细胞培养液的基础上,添加终浓度为lmmol/L 丙酮 酸 钠 (G I B C O /B R L ) 和 10ng/m l 重组人IL-4 (R & DSystem)。丙酮酸钠用于维持转染 细胞的活性。细胞通常每周传代2 次 ,每 隔 4 天 若 没 有 新 鲜 的 IL- 4 细胞将不能存活。 含 有 IL-4的新鲜培养基应每周配制一次。这种细胞的长期培养不应添加人IL- 2 , 因为 细胞会转而对培养上清中的IL-2依赖 ,而丧失对人IL- 4 的依赖性。冻存细胞时需要加 重 组 IL-4。

来源:丁香实验

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