一种快速鉴定细菌的方法

1980年代之前，细菌的分类和鉴定主要依靠形态学特征、培养特征、生理生化特征和免疫学反应进行。这些方法在细菌分类鉴定中发挥过重要作用，也存在着鉴定准确性差、繁琐耗时等缺点。随着分子生物学的飞速发展，特别是聚合酶链式反应技术(PCR)的发明，细菌的分类鉴定发生了重大革新，开始进入分子水平，一批分子鉴定方法也随之产生。其中16S rDNA基因的同源性分析已经成为细菌种属鉴定的标准方法，在细菌的分类研究中起着重要的作用。

16S rDNA基因存在于原核生物中。它由保守区和可变区组成，保守区为所有细菌所共有，细菌间没有差别；可变区在不同细菌之间存在不同程度的差异，具有属或种的特异性。细菌的16S rDNA序列长约1.6kb左右，其序列变化速度与进化速率相适应，因此被广泛用于种属鉴定。结合完善的数据库，16S rDNA序列分析可以快速准确的对微生物进行种属鉴定，确定微生物在进化中的位置。根据16SrDNA序列同源性分析建立细菌系统发育分类的准确性和重要性已经被越来越多的细菌分类学者所认识和接受。

扩增细菌的16S rDNA基因需要其染色体DNA作为模板。目前较常用的细菌染色体DNA 的小量制备方法是SDS碱裂解法和煮沸法，前者需多步酚抽提去除蛋白质，提取过程需要8h左右；而后者仅适用于少数种属的细菌。本文建立了1种新的从细菌中快速简便的批量提取染色体DNA 的方法，整个提取过程仅需20min。用该方法制备的染色体DNA无需任何处理即可作为模板用于PCR扩增细菌的16S rDNA序列。

一、材料与方法

1. 测试菌株

供研究的22株细菌分离物为本中心前期分离于云南等地土样并保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，编号为C1～C22。

2. 培养基

肉汁培养基、MRS培养基和高温菌培养基。

3. 测试菌株的培养

将C1～C22号测试菌株从甘油保藏管中接出，并在相应平板上划线。除高温菌平板在70℃ 培养外，其余平板都在37℃培养。

4. 细菌染色体DNA的快速提取

取1.5 mL离心管，称重。在管中加入100 L缓冲液I，从平板上刮数环菌于其中，振荡均匀，9 000r/min,3min。弃上清液，称重，计算出菌体质量。按照每毫克菌体10 L的比例，在离心管中加入缓冲液Ⅱ，将菌体振荡均匀，放置于75℃反应15min得到染色体DNA粗提液，直接用于后续PCR反应。

5. PCR扩增及产物测序

二、结果与讨论

1. 细菌染色体DNA快速提取方法的建立

研究试图建立一种适合大批量样本操作的细菌染色体DNA快速提取方法，并要求所建立方法制备的染色体DNA溶液不需经过任何后期处理便可直接用于后续的PCR反应。为此，对细菌染色体DNA快速提取方法中的2个关键溶液(缓冲液I和缓冲液Ⅱ)的配制和组成及其广泛应用性进行了研究和分析。缓冲液I中含有2 mmol/L的EDTA(pH8.0)和0.01 的Tw-20。缓冲液II由2mol/L的NaOH溶液组成，并用非离子型浓度相关性pH缓冲剂小心调节缓冲液Ⅱ的pH至13.4。

2. 提取的染色体DNA质量分析

（1）琼脂糖凝胶电泳检验

取细菌染色体DNA粗提液10ptL进行琼脂糖凝胶电泳，染色后凝胶成像。发现点样孔内很亮，孔外有连续条带存在。证明成功提取了22个测试菌株的染色体DNA。

（2）PCR 产物检验