非配对内切酶法-T7E1 法检测 TALEN 活性

TALEN 质粒构建好后，在进行动物或细胞操作前，最好检测其活性，确保 TALEN 的有效性，及减少后续筛选突变体的工作量，TALEN 活性越高，后续的筛选突变体的工作量越少。常用的检测 TALEN 活性的方法有以下 3 种：luciferase SSA 法、非配对内切酶法-T7E1 法和限制性内切酶法。

非配对内切酶法-T7E1 法的技术原理：如果通过 TALEN 发生突变，将基因组 DNA 做 PCR，并与野生型 DNA 的 PCR 产物等量混合，并退火杂交，将产生非配对 DNA 片段，将能被非配对内切酶-T7E1 剪切。若没有发生突变，将产生配对完整 DNA 双链，而无法被非配对内切酶-T7E1（或 surveyor）识别剪切。这种方法没有限制，基本上在转染效率高的细胞系就可以进行检测。

器材：

①凝胶电泳仪

②水浴锅

③低温离心机

④培养箱

⑤PCR 仪

试剂：

①琼脂糖

②卡那霉素；氯霉素；潮霉素，Proteinase K

③培养基

④T7E1 酶（T7 Endonuclease I，NEB：cat No．M0302S）（或 surveyor 酶）

非配对内切酶法-T7E1 法检测 TALEN 活性的主要操作步骤如下：

1）把 TALEN 质粒对共转染到相应的细胞系中，24～48 小时后，提取基因组 DNA，或做样品处理（参考唯尚立德公司的 easyPGenotyping Kit 试剂盒，货号：WS009），将离心好的细胞放入已加入 100 μl Extraction Buffer 的 PCR Tube 中，并加入 l μl Proteinase K（20 mg／mL），60 ℃ 加热 5 分钟后，98 ℃ 再加热 2 分钟，然后降至室温。

2）PCR 扩增 target site 周围序列（一般设计 300～600 bp，可参考检测 TALEN 靶点 SNP 时的引物和 PCR 条件）。体系和 PCR 程序参照 easyP Genotyping Kit 试剂盒。

3）拿到 PCR 产物后，将实验组与对照的 PCR 产物按体系加样，加样完毕后，进行退火变性复性，进行杂交处理（95 ℃ 5 分钟，自然冷却至室温）。