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非配对内切酶法-T7E1 法检测 TALEN 活性

相关实验:TALEN 的活性检测

最新修订时间:

简介

TALEN 质粒构建好后,在进行动物或细胞操作前,最好检测其活性,确保 TALEN 的有效性,及减少后续筛选突变体的工作量,TALEN 活性越高,后续的筛选突变体的工作量越少。常用的检测 TALEN 活性的方法有以下 3 种:luciferase SSA 法、非配对内切酶法-T7E1 法和限制性内切酶法。

原理

非配对内切酶法-T7E1 法的技术原理:如果通过 TALEN 发生突变,将基因组 DNA 做 PCR,并与野生型 DNA 的 PCR 产物等量混合,并退火杂交,将产生非配对 DNA 片段,将能被非配对内切酶-T7E1 剪切。若没有发生突变,将产生配对完整 DNA 双链,而无法被非配对内切酶-T7E1(或 surveyor)识别剪切。这种方法没有限制,基本上在转染效率高的细胞系就可以进行检测。

材料与仪器

器材:


①凝胶电泳仪


②水浴锅


③低温离心机


④培养箱


⑤PCR 仪


试剂:


①琼脂糖


②卡那霉素;氯霉素;潮霉素,Proteinase K


③培养基


④T7E1 酶(T7 Endonuclease I,NEB:cat No.M0302S)(或 surveyor 酶)


⑤easyPGenotyping Kit 试剂盒,货号:WS009

步骤

非配对内切酶法-T7E1 法检测 TALEN 活性的主要操作步骤如下:


1)把 TALEN 质粒对共转染到相应的细胞系中,24~48 小时后,提取基因组 DNA,或做样品处理(参考唯尚立德公司的 easyPGenotyping Kit 试剂盒,货号:WS009),将离心好的细胞放入已加入 100 μl Extraction Buffer 的 PCR Tube 中,并加入 l μl Proteinase K(20 mg/mL),60 ℃ 加热 5 分钟后,98 ℃ 再加热 2 分钟,然后降至室温。


2)PCR 扩增 target site 周围序列(一般设计 300~600 bp,可参考检测 TALEN 靶点 SNP 时的引物和 PCR 条件)。体系和 PCR 程序参照 easyP Genotyping Kit 试剂盒。


3)拿到 PCR 产物后,将实验组与对照的 PCR 产物按体系加样,加样完毕后,进行退火变性复性,进行杂交处理(95 ℃ 5 分钟,自然冷却至室温)。


4)分别加入 0.5 μl T7E1 酶(T7 Endonuclease I,NEB:cat No.M0302S)(或 surveyor 酶)进行酶切于上述 3 组处理中,37 ℃ 反应 30 分钟后,跑 2% 的琼脂糖凝胶电泳检测分析突变效果。

来源:丁香实验

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