内切酶星号活性

 

在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种"星号"活性可能是内切酶的一种普遍特性（1），如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实下列酶存在星号活性：Apo I（2）、Ase I（2）、BamH I（3）、BssH II（2）、EcoR I（4）、EcoR V（5）、Hind III（1）、Hinf I（6、7）、Pst I（8）、Pvu II（9）、Sal I（8）、Sca I（2）、Taq I（10）、Xmn I（2）。

酶识别特异性的改变受酶本身的性质及可能引起星号活性的反应条件影响。常见的引起酶识别改变的条件有：单碱基替换、识别序列外侧碱基缩短以及单链切刻（10）。Polisky等（4）对EcoR I的早期研究表明，在低盐浓度、高pH值条件下，EcoR I可能切割N/AATTN序列；最近，Gardner等（11）的研究表明，只要识别中心的四碱基序列（AATT）不出现A/T替换，EcoR I可以切割其它任何单碱基替代序列。

大多数星号活性是可以控制的，做酶切反应时一般不考虑这方面的因素。只要在正常条件下，使用随酶提供的NEBuffer，NEB的酶就不会出现星号活性。下面列出了导致或抑制星号活性的因素。

导致星号活性的因素：

1. 较高的甘油浓度（>5% v/v）；
2. 酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为>100 U/µg）；
3. 低盐浓度（<25 mM）
4. 高pH值（>pH 8.0）
5. 存在有机溶剂（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等）
6. 用其他二价离子替代镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）

以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些(2)。

抑制星号活性的方法：

1. 尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。
2. 尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。
3. 将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。
4. 将反应缓冲液的pH值降到7.0。
5. 二价离子用Mg++。

 

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