PCR 实验 protocol 汇总

带荧光标记的寡核苷酸探针分子小，偏振光弱。当探针与 DNA 上的特异片段结合后分子量增大，偏振光增强。在 PCR 扩增时，随着引物介导的新链形成，探针从模板上解离下来，重新成为游离状态，偏振光又减弱。在每一个 PCR 循环退火阶段，探针又可与 DNA 链重新配对，偏振光增强。在此阶段检测偏振光的增值，可对其进行定量检测。而当所扩增的核酸序列中不含与探针相配对的特定 DNA 片段时，荧光探针无法与核

一、材料 1. 缓冲液、溶液和试剂 矿物油（可选） 2. 核酸和寡核苷酸 来自方案 3 的 cDNA 3. 专用设备 热循环仪 [推荐使用 GeneAmpPCRSystem9600(Perkin-Elmer)，或者 Mastercyder(EppendorfScientific)] 0.2 ml 薄壁 PCR 管 4. 附加试剂 RNAspectraFluorescentmRNA

常规巢式 PCR 通过两轮 PCR 反应，使用两套引物扩增特异性的 DNA 片段。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮 PCR 产物内的一段 DNA 片段。

半巢式 PCR 是利用三条引物进行两次 PCR 扩增的方法，与巢式 PCR 原理相同，只是在第 2 轮 PCR 反应中使用的引物有 1 条为第 1 轮 PCR 的引物。

反转录巢式 PCR(RT－nested PCR)是在反转录 PCR 的基础上发展起来的，在通过反转录获得 cDNA 的基础上，对目的基因进行巢式 PCR 扩增。它和简单的反转录 PCR －样是用于检测某种 RNA 是否被表达，或者比较其相对表达水平，但是特异性更高、可靠性更强。

序列特异性引物 PCR，英文名是 sequence specific primer， PCR－SSP，借助 PCR 技术获得 HLA 型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定 HLA 型别，从而大大简化了实验步骤，具有简单易行的优点，分辨率可从低到高，成本低，在 HLA 分型中得到了广泛应用。

常规 PCR 反应可以扩增到 3~4 kb 的 DNA 片段，而超过 5 kb 的 DNA 片段就已经很难扩增出来了。虽然有人可以扩增出 5~15 kb 的 DNA 片段，但产量很低。造成常规 PCR 扩增长片段 DNA 效果不好的原因有以下几点：① 常规 PCR 反应中应用的耐热 DNA 聚合酶（如酶）缺乏 3'→5' 核酸外切酶活性，不具备很好的校读功能，因而具有较高频率的错误碱基的掺入，不能

环介导恒温扩增是指在 60~65 ℃ 等温环境下，DNA 处于动态平衡状态，在此温度下利用 4 种特异引物依靠一种高活性链置换 DNA 聚合酶，使 DNA 在短时间内进行核酸扩增的技术。反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。

多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种模拟天然 DNA 复制过程，在体外扩增特异性 DNA（或 RNA）片段的新技术。

不必提取目的基因 DNA，不必酶切鉴定，直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行 PCR 扩增与鉴定。

通用 PCR 技术，英文名是 universal PCR，是由 Mullis 等在 1983 年建立的 PCR 技术，已成为分子生物学、遗传学等学科研究领域的经典实验方法。近年来，该技术本身获得了长足发展，可靠性不断提高，在 PCR 基本原理的基础上，发展了一系列新的概念和实验方法，在生命科学研究中具有重要价值。随着该技术应用的普及和深入，某些问题也越来越突出。其中问题之一是引物，引物设计的合理与

基于 PCR 的长 DNA 序列准确合成的方法（PCR-based accurate synthesis， PAS）相对简便（只需要 2 步 PCR）、快速、准确（每合成 1 000 bp 错配 ≤ 1）和廉价，已经成功合成了大量的基因，包括含高（G + C）含量、重复序列和复杂的二级结构的基因。Xiong 等人应用 PAS 法合成了枯草芽弛杆菌次次操纵子的一个 12 kb 的 DNA 片段。运用

定量甲基化特异性 PCR（quantitative methylation specific PCR, qMSP）是一种用于检测 DNA 甲基化程度的分子生物学方法，可测定 DNA 特定位点甲基化状态的百分比，适用于描述甲基化在基因表达中的作用以及疾病发生发展的分子生物学机制研究等领域。

一、材料 1. 试剂 甜菜碱（Sigma 公司） dNTP 溶液（含四种 dNTP, 每种 25 mmol/L) 二甲基亚砜（DMSO)(Sigma 公司） 四甲基砜（Sigma 公司） 2. 酶和酶缓冲液 Taq 酶 Taq 酶缓冲液（Taq 酶制造商提供） 3. 核酸和寡核苷酸 人类基因组 DNA，每个反应中 20ng， hRF3(hGSPTl) 引物：hRF3f C

在标准 PCR 反应条件下，PCR 扩增 DNA 片段的长度一般为 1~2 kb，这种扩增能力对许许多多常规的 DNA 分子操作技术要求来说是已经足够了（如 DNA 序列分析和基因突变等)，但是对于扩增某些大的完整的哺乳动物基因组基因，甚至中等大小的基 因组基因以及对于一种平均长度的全长 dDNA，这种 PCR 扩增能力还是远未达到实验要求的。

热不对称 PCR 的发展和应用使的不对称 PCR 方法变得更加简单和实用，而 Yao-Guang Liu 等后来又将其进一步发展产生了 TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）：交错式热不对称 PCRIS。TAIL-PCR 的目的是为了扩增与已知序列相邻的未知序列，相对于实现同样目标的其它方法 TAIL-PCR 具有非常明显的优点。

共有序列巢式 PCR (consensus nested PCR)， 又称为共有引物巢式 PCR (consensus primer nested PCR)， 根据同一种属内较为保守的序列，设计简并引物，通常第一轮 PCR 引物的简并碱基较多，第二轮 PCR 引物的简并碱基较少一些，扩增长度为 200~300 bp。

甲基化特异性 PCR是利用2套不同的引物对，分别针对甲基化和非甲基化的 DNA 片段进行扩增。根据能否扩增出相应大小的片段来判断 CpG 位点是否发生甲基化这种方法已成为甲基化检测的经典方法。

聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法。双链 DNA 分子在临近沸点的温度下加热时分离成两条单链 DNA 分子（变性过程），一对引物分别和两条 DNA 分子特异位置结合（退火过程），在适宜温度下，DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷酸为原料，产生出新的 DNA 分子（延伸过程

数字 PCR 即 Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于 qPCR，数字 PCR 可让你能够直接数出 DNA 分子的个数，是对起始样品的绝对定量。