🔥 LAMP（环介导等温扩增）

环介导恒温扩增是指在 60~65 ℃ 等温环境下，DNA 处于动态平衡状态，在此温度下利用 4 种特异引物依靠一种高活性链置换 DNA 聚合酶，使 DNA 在短时间内进行核酸扩增的技术。

反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。

材料：质粒提取试剂盒、引物、DNA 聚合酶、dNTPs Mix、基因组 DNA；

仪器：梯度 PCR 仪，浊度仪等。

1. 引物设计

根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）（nih.gov）选取目的基因，进行序列比对，根据序列比对结果选择保守区段，运用在线软件 Primer 设计 LAMP 引物，由北京擎科生物科技有限公司合成。

2. 含有目的基因 LAMP 检测模板的制备

扩增目的条带，并连接至适合的载体上，通过单克隆挑菌，摇菌等方法获得目的质粒，并按照说明方法提取质粒。

3. LAMP 反应体系及其优化

1）LAMP 反应体系 

内引物（100 μmol/L）各 0.4 μL、外引物（10 μmol/L）各 0.5 μL、DNA 聚合酶 1 μL、模板 1μL、dNTPs（25 mmol/L）1.4μL、Mg²⁺（100 mmol/L）1.5μL 和 10 × Thermopol Buffer 2.5 μL，以 ddH₂O 补至 25 μL。

2）LAMP 反应体系的优化 

LAMP 反应温度分别设为 60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃ 和 65 ℃，以确定体系的最佳反应温度；反应时间设为 15~60 min/组，共 10 组，各组间隔 5 min；Ｍg²⁺ 终浓度梯度分别设为２、４、８、12、16 mmol/L，即分别加入 100 mmol/L

Mg²⁺ 储存液 0.5、1、2、3、4 μL；不同的内外引物加入终浓度比例分别设为 2:1、4:1、8:1、16:1、32:1（固定添加 0.5 μL 外引物）；DNA 聚合酶加入量设为４、８、16、32 Ｕ（分别对应加 0.5、1、2、3、4 μL DNA 聚合酶）。

反应结束后，取样品 2.5 μL 和 ６× DNA 上样缓冲液 0.5 μL 混合，经２％ 琼脂糖凝胶电泳分离后判定检测结果，阳性结果显示特征性阶梯状条带，阴性结果无此特征性条带。

3）目的基因片段 LAMP 检测的特异性和灵敏度

特异性检测以基因组 DNA 为模板（1 μL）进行特异性检测。同时以含有目的基因质粒为阳性对照，在优化过的最佳反应温度和反应时间下进行反应，反应完成后，经琼脂糖凝胶电泳检测结果。

灵敏度检测：将含有目的基因的质粒，用 ddH₂O 稀释成 5、10、50、10²、10³、10⁴、10⁵copies/μL，取 1 μL 作为模板在优化过的最佳反应温度和反应时间下进行反应，反应完成后经琼脂糖凝胶电泳检测并判定结果。

4. 延伸反应

筛选出相应的反应体系后，进行变性退火将反应体系（除酶外）在 95 ℃ 加热 5 min 后，冷却，再加入 DNA 聚合酶；等温延伸，在筛选的时间下保温延伸一定时间；终止反应在高于 80 ℃ 的温度下加温 2 min 终止反应。

5. 通过观察白色沉淀的量来检测 LAMP 增产物

随着 LAMP 反应的进行，dNTP 会释放出焦磷酸根离子，生成焦磷酸镁白色沉淀。生成的白色沉淀与反应液中双链 DNA 的量是成正比的，因此可以通过浊度仪检测白色沉淀的量来定性反应的进行程度。只有当反应体系中 dNTP 的量达到 0.5 M 时才有可能肉眼观测到沉淀。

1、LAMP 扩增是链置换合成，基因长度最好在 300 bp 内。

2、LAMP 特异性高，易受到污染产生假阳性，实验过程中要注意，防止污染。