常规巢式 PCR

常规巢式 PCR 通过两轮 PCR 反应，使用两套引物扩增特异性的 DNA 片段。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮 PCR 产物内的一段 DNA 片段。

巢式 PCR 的基本原理是是利用第 1 轮 PCR 产物作为第 2 轮 PCR 的模板，除使用第 1 轮的 1 对特异引物之外，在第 2 轮 PCR 反应中，使用 1 对新的特异引物，它们与模板 DNA 的结合位点处于第 1 轮引物扩增出的 DNA 片段内，这样在第 2 轮中错误扩增的可能性极低。

器材：PCR 扩增仪、电泳仪

试剂：

① 模板： 基因组 DNA 或 cDNA

② 2.5 mmol/L dNTP 混合液

③ 10 umol/L 四条特异引物： 两条外引物，两条内引物

④ TaqDNA 聚合酶及其 10× PCR 缓冲液

⑤ 高压灭菌去离子水

常规巢式 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

巢式 PCR 的引物设计原则与常规 PCR 相同。通常内引物与外引物间隔多长距离也没有统一的要求，具体情况根据每个实验而定。

（二）巢式 PCR 反应

A. PCR 反应体系：

设立 50 pl 的 PCR 反应体系，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

DNA 模板 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 （5 U/μl） 0.5 μl

10 μmol/L 的外引物 （P1 ，P2） 各 1 μl

H₂O 至 50 μl

如果 PCR 仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油 （约 50 μl）。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

B. 设置 PCR 反应条件：

预变性 94 ℃，3 min

变性 94 ℃，30 s

退火 55 ℃，30 s 30 个循环

延伸 72 ℃，60 s

延伸 72 ℃，7 min

PCR 反应中的温度要根据具体反应而定，一般来说每分钟合成 1000 bp 左右。

C. 进行第二轮 PCR 反应，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

cDNA 模板 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 （5 U/μl） 0.5 μl

10 μmol/L 的内引物 （P3 ，P4） 各 1 μl

H₂O 至 50 μl

PCR 反应条件同第一轮。

D. PCR 产物的检测

反应结束后，用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。