巢式 PCR

PCR 技术

别名：

nested PCR

最新修订时间：2022-05-19

简介

巢式 PCR 是利用第 1 轮 PCR 产物作为第 2 轮 PCR 的模板，除使用第 1 轮的 1 对特异引物之外，在第 2 轮 PCR 反应中，使用 1 对新的特异引物，它们与模板 DNA 的结合位点处于第 1 轮引物扩增出的 DNA 片段内，这样在第 2 轮中错误扩增的可能性极低。

目前用于巢式 PCR 的方法主要有 7 种：常规巢式 PCR、半巢式 PCR、反转录巢式 PCR、共有序列巢式 PCR、种特异巢式 PCR、巢式 PCR－变形梯度凝胶电泳、巢式 PCR－限制性片段长度多态性。

原理

巢式 PCR 的基本原理是是一种 PCR 改良模式，它由两轮 PCR 扩增和利用两套引物对所组成，首先对靶 DNA 进行第一步扩增，然后从第一次反应产物中取出少量作为反应模板进行第二次扩增，第二次 PCR 引物与第一次反应产物的序列互补），第二次 PCR 扩增的产物即为目的产物。使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是 15～30 个循环的标准扩增，将一小部分起始扩增产物稀释 100～100 倍（或不稀释）加入到第二轮扩增中进行 15～30 个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。两套引物的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少，而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30～40）会扩增非特异性靶位点。巢式 PCR 可以增加有限量靶序列（如稀有 mRNA）的灵敏度，并且提高了一些有难度的 PCR （如 5＇ RACE）的特异性。

来源：丁香实验

操作方法

基本方案

1. 目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片断（图中未显示可能的多种产物）。 2. 使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。第一轮 1. 大小：1192 bp 2. 初始孵育：94℃4分钟 3. 变性：94℃45秒 4. 退火：58℃45秒 5

常规巢式 PCR

常规巢式 PCR 通过两轮 PCR 反应，使用两套引物扩增特异性的 DNA 片段。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮 PCR 产物内的一段 DNA 片段。

半巢式 PCR

半巢式 PCR 是利用三条引物进行两次 PCR 扩增的方法，与巢式 PCR 原理相同，只是在第 2 轮 PCR 反应中使用的引物有 1 条为第 1 轮 PCR 的引物。

反转录巢式 PCR

反转录巢式 PCR(RT－nested PCR)是在反转录 PCR 的基础上发展起来的，在通过反转录获得 cDNA 的基础上，对目的基因进行巢式 PCR 扩增。它和简单的反转录 PCR －样是用于检测某种 RNA 是否被表达，或者比较其相对表达水平，但是特异性更高、可靠性更强。

共有序列巢式 PCR

共有序列巢式 PCR (consensus nested PCR)，又称为共有引物巢式 PCR (consensus primer nested PCR)，根据同一种属内较为保守的序列，设计简并引物，通常第一轮 PCR 引物的简并碱基较多，第二轮 PCR 引物的简并碱基较少一些，扩增长度为 200~300 bp。

种特异巢式 PCR

种特异巢式 PCR 是针对种特异的基因设计引物，能够区分同一属内不同种的微生物。

巢式 PCR－变性梯度凝胶电泳

巢式 PCR－变性梯度凝胶电泳（nested PCR－DGGE）是将巢式 PCR 与变性凝胶梯度电泳（denaturing gradient gel electrophoresis， DGGE）结合起来的一种 PCR 技术方法。

巢式 PCR－限制性片段长度多态性

巢式 PCR－RFLP(nested PCR－RFLP)是将限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism,RFLP) 与巢式 PCR 技术相结合，通过设计高度保守序列的引物对待检物种 DNA 进行 PCR 扩增，对 PCR 产物进行 RFLP 分析。

🔥 巢式 PCR

一、第一轮 PCR 扩增目的 DNA 模板与第一对外侧的引物结合后进行 PCR 扩增。由于只有一对引物可能发生特异性结合，产物中会有目的基因片段和非特异性片段。条件设置：1. 预变性：94 ℃，4 分钟；2. 变性：94 ℃，45 秒；3. 退火：58 ℃，45 秒；4. 延申：72 ℃，45秒；5. PCR 循环：36个二、第二轮 PCR 扩增使用目的基因内侧的第二对引物，即巢式引物，对第一轮