巢式 PCR－变性梯度凝胶电泳

巢式 PCR－变性梯度凝胶电泳 （nested PCR－DGGE） 是将巢式 PCR 与变性凝胶梯度电泳 （denaturing gradient gel electrophoresis， DGGE） 结合起来的一种 PCR 技术方法。

巢式 PCR－变性梯度凝胶电泳的基本原理是：DGGE 是一种电泳分析系统，利用序列不同的 DNA 片段在聚丙烯酰胺凝胶中解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将 DNA 片段分开。当双链 DNA 分子在变性凝胶中进行电泳时，其解链的速度和程度与其 序列组成密切相关，相同长度的双链 DNA 分子由于碱基对组成的不同，解链所需要的变性剂浓度也不同，当某一双链 DNA 序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时，即开始部 分解链，部分解链的 DNA 片段在胶中的迁移速度急剧降低。因此具有不同序列的 DNA 片段则 停留于凝胶的不同位置，形成相互分开的条带图谱。理论上只要选择的电泳条件足够精细，最低可检测到只有一个碱基差异的 DNA 片段 （≤ 500bp）。

器材：PCR 扩增仪、BioRad Dcode 系统

试剂：

① 模板： 基因组 DNA 或 cDNA

② 2.5 mmol/L dNTP 混合液

③ 10 umol/L 四条特异引物： 两条外引物，两条内引物

④ TaqDNA 聚合酶

⑤ 10× PCR 缓冲液：15 mmol/L MgCl_2》，500 mmol/L KCl， 100 mmol/L Tris－Cl， 0.1％ （体分数）Triton X－100

⑥ 高压灭菌去离子水

⑦ 丙烯酰胺、双丙烯酰胺

⑧ 去离子甲酰胺和尿素

⑨ 溴化乙锭

巢式 PCR－变性梯度凝胶电泳的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

巢式 PCR 的引物设计原则与常规 PCR 相同。通常内引物与外引物之间的间隔距离也没有统一的要求，具体情况根据每个实验而定。

（二）巢式 PCR 反应

A. PCR 反应体系：

设立 50 pl 的 PCR 反应体系，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

DNA 或 cDNA 模板 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 （5 U/μl） 0.5 μl

10 μmol/L 的外引物 （P1、P2） 各 1 μl

H₂O 至 50 μl

如果 PCR 仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油 （约 50 μl）。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

B. 设置 PCR 反应条件：

预变性 94 ℃，3 min

变性 94 ℃，30 s

退火 55 ℃，30 s 30 个循环

延伸 72 ℃，60 s

延伸 72 ℃，7 min

PCR 反应中的温度要根据具体反应而定，一般来说每分钟合成 1000 bp 左右。

C. 进行第二轮 PCR 反应，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

cDNA 模板 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 （5 U/μl） 0.5 μl

10 μmol/L 的内引物 （P3 ，P4） 各 1 μl

H₂O 至 50 μl

PCR 反应条件同第一轮。

D. PCR 产物的检测

DGGE 系统要求在聚丙烯酰凝胶中对待测 DNA 片段电泳，电泳的温度维持在仅低于待测解链区域 Tm 值几摄氏度。对绝大多数天然的 DNA 片段 60 ℃ 是合适的。

制备 10％ 聚丙烯酰胺凝胶（丙烯:双丙烯 ＝ 37.5:1），变性剂梯度范围为 30％~60％（100％ 变性为 40 g/dL 甲酰胺及 7 mol/L 尿素），呈线性梯度增加，方向与电泳方向平行。

DGGE 电泳凝胶制备过程如下：

a. 灌胶玻璃和垫条的处理：用清洁液仔细清洁玻璃板，横擦竖擦 3 遍，用自来水彻底清洗 后再用去离子水冲洗干净，操作时必须戴手套，取板时握住板的边缘，以避免手上的油脂印在板 的工作面上。

b. 灌胶玻璃板的安装与封闭：将长板平放在桌上，将垫条放置于两侧，放上短玻璃板，对齐。参照 Bio－Rad Dcode system 说明书操作。

c. 凝胶板的制备：用 50× TAE、 40％ 丙烯酰胺－双丙烯酰胺(37.5:1)配制，分别加入高浓度变性剂和低浓度变性剂的 8％ 聚丙烯酰胺凝胶，凝胶中的 TAE 浓度为 1 倍，以 42 g 尿素和 40 ml 甲酰胺为 100％ 变性剂。将两种变性剂浓度的 8％ 丙烯酰胺溶液分别吸入两个注射器，将两个注射器放在梯度形成器的正确位置，缓慢且均匀地转动轮子，以便形成线性梯度，直至灌满至玻璃板顶部，然后立即插入梳子待胶凝固，凝胶大小选用 16 cm×16 cm × 0.75 mm。

d. 凝胶老化：凝胶室温放置 2 h， 取出梳子，用 1×TAE 溶液冲洗凝胶孔，以除去可能存在 的未聚合的丙烯酰胺。

DGGE 电泳过程如下：

a. 预热缓冲液：配制 7 L 1×TAE 缓冲液，上样前将缓冲液加热到 60 ℃。

b. 加样：取 9 μl PCR 纯化产物与 1 μl 10×上样缓冲液混合，注入到加样孔底部。

c. 电泳：电泳温度为 60 ℃，变性剂浓度以 0~100％ 为最大区间，电压从 120~200 V， 电泳时间 4~8 h，经过多次垂直电泳实验来选择最佳实验条件。

d. 聚丙烯酰胺凝胶的浓度、电泳时间可主要根据所分离的 PCR 扩增片段的大小来决定，染色方法除用银染外，还可用溴化乙锭、SYBR Green I 核酸染色液（1:10000 稀释度，Rockland，USA）等方法。

DGGE 电泳成像如下。

DGGE 指纹图谱构建采用 DCode^TM 基因突变检测系统（BioRad， 美国），溴化乙锭或其它方法染色后，在凝胶成像系统中扫描照相，利用 Bio－1D ＋＋软件对 DGGE 指纹图谱进行分析。

一般认为，扩增片段大小对 DGGE 分析有较大的影响。当片段长度大于 500 bp 时，会使 DGGE 的分辨率下降，200 bp 左右的片段被认为是分离效果最好的片段。