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🔥 巢式 PCR

相关实验:巢式 PCR

别名:双重 PCR,共有引物 PCR,增效 PCR,巢式扩增

最新修订时间:

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审核专家 | 王永芹硕士

药理学 中国科学院大学

原理

使用扩增片段的内外两对引物进行两轮 PCR 扩增来提高引物与目的基因片段的特异性和灵敏性,以防止非特异性结合和非特异性产物的生成。

用途

常规使用的一对引物的 PCR 可能会发生引物与模板的非特异性结合,为了提高特异性,选用目的基因内外两层引物进行两轮扩增,在前一轮的产物中进行二次筛选,双重保险以获得特异性的目的片段。

常用于高遗传变异性的病毒检测以提高检测率,也可用于常规 PCR 扩增产物时,核酸胶检测产物弥散高亮,但未出现明显条带时;也适用于模板质粒质量差或丰度较低时。

材料与仪器

试剂:

① 灭菌水

② Fast Pfu DNA 聚合酶及 PCR 缓冲液

③ 模板质粒以及内外两对引物

④ dNTP mix DNA 纯化回收试剂盒

仪器:PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、枪头和移液器

步骤

一、第一轮 PCR 扩增

目的 DNA 模板与第一对外侧的引物结合后进行 PCR 扩增。由于只有一对引物可能发生特异性结合,产物中会有目的基因片段和非特异性片段。

条件设置:

1. 预变性:94 ℃,4 分钟;

2. 变性:94 ℃,45 秒;

3. 退火:58 ℃,45 秒;

4. 延申:72 ℃,45秒;

5. PCR 循环:36个

二、第二轮 PCR 扩增

使用目的基因内侧的第二对引物,即巢式引物,对第一轮的 PCR 产物进行扩增,双重筛选以调取目的基因片段。PCR 反应条件同第一轮。

三、PCR 产物的检测

将两轮 PCR 产物进行凝胶电泳分析,以检验产物片段大小是否正确,进行胶回收 DNA 纯化,转化后挑克隆送测序。

注意事项

1、注意检测模板质粒质量以及各引物浓度;

2、外侧引物比内测引物的 Tm 值高 4 ℃ 以上;

3、外侧引物距离内侧引物要多于 6 bp;

4、第一轮 PCR 扩增时,应尽量摸索最低的外侧引物加入量,并增加扩增循环数,以消耗尽外侧引物,避免第二轮时继续扩增造成非特异性污染。

常见问题

1、一轮用外侧引物 PCR 产物中出现非特异性条带

原因常见:

引物与靶序列不完全互补,非特异性结合用巢式 PCR 解决。但也可能是由于引物浓度过高、聚合形成二聚体/酶的质和量不佳/退火温度过低/ PCR 循环数过多所致,

对策:

必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93 ℃ 变性,65 ℃ 左右退火与延伸)等

2、PCR 扩增产物出现片状拖带/涂抹带

往往是由于模板质粒质量不好、酶量过多、dNTP 浓度过高、循环次数过多时引起,常规 PCR 出现非特异性结合的情况极少,建议先排查掉这些原因再进一步使用巢式 PCR。

来源:丁香实验

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