PCR扩增，长度符合预期，但是测序回来的序列经对比后，不符合要求。

出现目的片段与预期不符的情况可能有以下几个可能原因：

1. 污染或混合：在连接载体和转化涂板的过程中，可能存在外源性DNA的污染或混合，导致测序结果显示的不是您所期望的目的片段。这可能是由于工作台、试剂、PCR管或其他实验室环境中存在其他DNA片段的污染所致。为了避免这种情况，建议在实验室操作中严格控制污染，注意无菌操作，并避免试剂和操作工具的交叉污染。

2. 扩增过程中的错误：在PCR扩增目的片段的过程中，可能发生了错误。这可能包括引物的选择不正确、温度梯度设置不合适、扩增时间过短或过长等。确保引物序列正确，并且扩增条件和时间适当，以获得准确的目的片段。

3. 连接载体的问题：连接载体的过程中可能出现了错误，例如连接反应不完全、连接酶的活性不佳或连接条件不恰当等。确保连接载体的反应条件和酶的活性符合要求，并进行适当的控制实验来验证连接反应的效果。

4. 测序错误：在测序过程中，可能出现了错误的测序结果。测序方法和设备可能存在技术问题或人为操作失误。在这种情况下，建议再次进行测序或与测序服务提供商联系，确保准确的测序结果。

1.引物问题，可以blast排除一下其他扩增产物，如果结果没问题，提高退火温度试试，可以增加引物特异性。

2.测序订单问题，核对一下选择的引物有没有包含想要测序的片段。

我也觉得是引物出现了问题，排查下引物吧

这个有可能是引物特异性不好，扩增出了其他形式的产物，导致连接的时候出现问题，造成结果错误