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半巢式 PCR

相关实验:巢式 PCR

别名:semi-nested PCR

最新修订时间:

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合作专家 | 徐颖博士

结构生物学 中国科学技术大学

简介

半巢式 PCR 是利用三条引物进行两次 PCR 扩增的方法,与巢式 PCR 原理相同,只是在第 2 轮 PCR 反应中使用的引物有 1 条为第 1 轮 PCR 的引物。

原理

半巢式 PCR 的基本原理是当用于当模板 DNA 含量较低时,一次 PCR 难以得到满意的结果,需要进行两轮 PCR 扩增,与巢式 PCR 相比,在基因的 5' 末端或者 3' 末端无法设计出两条引物外引物和内引物,只能设计出一条引物的情况下,宜采用半巢式 PCR。

材料与仪器

仪器:PCR 扩增仪、电泳仪、移液器;

试剂:

① 模板:基因组 DNA 或 cDNA;

② 2.5 mmol/L dNTP 混合液;

③ 10 μmol/L 三条特异引物:两条外引物,一条内引物;

④ Taq DNA 聚合酶及其 10× PCR 缓冲液;

⑤ 高压灭菌去离子水;

耗材:PCR 管、移液枪头。

步骤

半巢式 PCR 的基本过程可分为如下几步:

(一)引物设计

在某些情况下,由于所要研究的基因位于整个基因组的 5' 末端或者 3' 末端,这样在基因的 5' 末端或者 3' 末端就无法设计出两条引物——外引物和内引物,只能设计出一条引物,而在基因的另一端仍然可以设计两条引物,在两次 PCR 中有一端的引物要利用两次,半巢式 PCR 的引物设计原则与常规 PCR 相同,共设计三条引物。内引物与外引物间隔多长距离没有统一的要求,具体情况根据每个实验而定。

(二)半巢式 PCR 反应:

A. PCR 反应体系:进行第一轮 PCR 反应,50 μl 的 PCR 反应体系,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入:10× PCR 缓冲液 5 μl,DNA 模板 3 μl,2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl,Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.5 μl,10 μmol/L 的外引物(P1,P2)各 1 μl,最后加 H2O 至 50 μl。

B. 如果 PCR 仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油(约 50 μl)。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

C. 设置 PCR 反应条件:预变性 94 ℃,3 min,变性 94 ℃,30 s,退火 55 ℃,30 s,延伸 72 ℃,60 s,30 个循环,延伸 72 ℃,7 min。

D. 进行第二轮 PCR 反应,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入:10× PCR 缓冲液 5 μl,第一轮 PCR 扩增产物 3 μl,2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl,Taq  DNA 聚合酶(5 U/μl)0.5 μl,10 μmol/L 的外引物(P1 或 P2)和内引物 P3 各 1 μl,H2O 至 50 μl。PCR 反应条件同第一轮,反应中的条件与循环数视具体情况而定。

E. 有些情况下,也可进行一管式半巢式 PCR,例如 50 μl 的反应体系,分别加入:10× PCR 缓冲液 5 μl,模板 3 μl,2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl,Taq  DNA 聚合酶(5 U/μl)5 μl,10 μmol/L 的外引物(P1、P2、P3)各 1 μl,H2O 至 50 μl。PCR 反应条件同第一轮,反应中的条件与循环数视具体情况而定。反应结束后,用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

注意事项

1、PCR 反应中的退火温度要根据引物的 Tm 值而定,延伸时间根据酶的合成速度和扩增条带的长度设定,一般来说每分钟合成 1 000 bp 左右。

2、半巢式 PCR 较巢式 PCR 反应特异性有所降低,易造成非特异产物,为了克服这个缺点,可以采取提高退火温度,从常用的 55 ℃ 提高为 60 ℃。从而使模板与引物之间的识别特异性提高,以提高反应的特异性。

3、半巢式 PCR 多采用第一轮产物直接稀释作为第二轮循环模板,此稀释混合物中的引物和模板对于第二轮扩增有一定干扰作用,易造成背景高、非特异产物多的缺点,通过对第一轮产物的初步分离获得纯化的核酸产物,再作为第二轮循环模板可得到更为理想的结果。

来源:丁香实验

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