巢氏pcr，两次程序都一样，这种杂带比较多怎么修改程序

你可以适当延长退火时间，降低退火温度

考虑还是引物的问题，可以重新设计引物

这种杂带怀疑是第一次引物造成了两次引物之间相互配对引起多条带扩增，建议第二次PCR做个交叉实验做对照，就知道是不是混合引起了。如果是混合引起，建议：减少第一次引物的量，并增加循环次数，尽量消耗完首次引物

可以尝试以下方法来修改PCR程序以减少或消除这些杂带：

1. 优化退火温度：调整巢式PCR中的退火温度。退火温度应适当高于引物的融合温度，以确保特异性扩增。尝试降低退火温度，可能有助于减少非特异性扩增引起的杂带。

2. 优化引物浓度：适当调整引物的浓度。引物过多可能导致非特异性扩增，而引物过少则可能影响扩增效率。通过尝试不同的引物浓度，可以找到最佳的扩增条件。

3. 增加退火时间：延长退火步骤的时间，以确保引物与目标序列充分结合。适当增加退火时间可以提高特异性扩增的选择性，从而减少杂带。

4. 优化延伸时间：延长延伸步骤的时间，以确保DNA链的完全延伸。如果延伸时间太短，可能导致不完全扩增产物的积累，从而引起杂带。尝试适当增加延伸时间，以获得更好的扩增效果。

5. 添加PCR增强剂：考虑使用PCR增强剂，如二聚体酶抑制剂（如Bovine Serum Albumin，BSA）或聚乙二醇（PEG），以减少非特异性扩增。这些增强剂可以改善引物与非特异性结合的竞争关系，从而有助于减少杂带的出现。

6. 设计新的引物：重新设计引物，确保其与目标序列的特异性更高。使用特异性较好的引物可能有助于减少非特异性扩增和杂带的产生。