PCR扩增不出来，该怎么改进？

可能原因及解决方案

一、DNA模板

1、完整性较差

建议方法：

1）在分离DNA时，尽量减少对DNA的切断或切刻。如有需要，可通过 凝胶电泳检测模板DNA完整性。

2）将DNA保存于 分子级别的水 或 TE缓冲液 （pH 8.0）中，防止被核酸酶降解。

2、低纯度

建议方法：

    1）使用纯化试剂盒分离模板DNA时，应严格遵循试剂盒生产商的建议。查阅用户手册和疑难问题指南，改善较低的DNA质量。

2）如果采用化学或酶促DNA纯化方案，应确保无PCR抑制剂残留，如苯酚、EDTA和蛋白酶K。

3）使用70%乙醇再纯化或沉淀和洗涤DNA，去除可能会抑制DNA聚合酶的残留盐分或离子（如， K+, Na+等）。

4)选择具有 高合成能力的DNA聚合酶，这类聚合酶对土壤、血液和植物组织携带的常见PCR抑制剂具有较好的耐受性。

3、用量不足

建议方法：

1)检查 DNA起始量 ，如有需要适当增加起始量。

2)选择具有 高灵敏度 的DNA聚合酶用于扩增。

3)适当增加PCR循环数。

4、复杂的目的片段（如，高GC含量或含二级结构）

建议方法：

   1)选择具有 高合成能力的DNA聚合酶，这类酶对DNA模板的亲和力较高，更适合扩增困难靶标。

2)使用 PCR添加剂或辅助溶剂 ，促进富含GC的DNA和具有二级结构的序列变性。

3)增加 变性时间或温度 ，从而高效解离双链DNA模板。

5、长片段

建议方法：

1)确认所选DNA聚合酶的长片段扩增能力。使用专为 长片段PCR设计的DNA聚合酶。

2)选择具有 高合成能力的DNA聚合酶，这类酶能够在短时间内扩增长片段。

3)降低退火和延伸温度，促进引物结合和提高酶热稳定性。

4)根据扩增子长度，增加延伸时间

考虑以下几点原因及建议：

1、酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

2、模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

3、变性温度是否准确。PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

4、反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶。应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5－10分钟。

5、引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

先排除一下降解问题，感觉是降解的原因所以扩增不出来

1. 检查 DNA起始量 ,如有需要适当增加起始量。

2. 选择具有 高灵敏度 的DNA聚合酶用于扩增。

3. 适当增加PCR循环数。

样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好，而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利！